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莱菔硫烷对肝脏脂肪滴形成的影响及MAM区的调控机制

田思聪  
【摘要】:非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是以脂滴(lipid droplets,LDs)过度沉积于肝脏为特征的脂代谢紊乱疾病,可直接导致非酒精性脂肪肝炎、肝硬化、最终发展成肝癌。莱菔硫烷(sulforaphane,SFN)是富含于十字花科蔬菜中的一种异硫氰酸酯(isothiocyanates,ITCs)类植物化学物,具有多种生物学功能。前期研究发现,SFN能够改善糖尿病、肥胖和酒精性肝损伤等糖脂代谢紊乱引起的代谢型疾病,但SFN对高脂摄入引起的NAFLD是否也具有改善作用,及可能的作用机制尚未见报道。本文采用高脂膳食(highfat diet,HFD)建立NAFLD整体动物模型,以脂肪酸(fatty acid,FA)诱导HHL-5肝细胞为体外模型,并以SFN为干预因素,内质网(ER)与线粒体(MT)偶联区(MAM)作为主要研究核心,探讨SFN对肝脏脂滴形成的影响和改善NAFLD的分子机制。分别用HFD喂养大鼠10周,250 μmol/LFA诱导HHL-5肝细胞5 d,成功建立体内及体外肝细胞脂肪变模型。分别以不同剂量SFN(5,10,20 mg/kg)经口灌胃大鼠10周,及SFN(1,5,10,20μmol/L)处理HHL-5肝细胞,可降低大鼠血清和肝脏及HHL-5肝细胞中甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)含量。HE和油红O染色病理观察发现,SFN明显改善肝脏病理损伤,减少脂滴数量和平均面积。采用Western blot方法检测脂滴核心组份TG和TC合成关键酶二脂酰甘油酰基转移酶2(DGAT2)和胆固醇酰基转移酶(ACAT1)蛋白水平发现,SFN抑制其表达。Real-time PCR、免疫组化和Western blot方法检测脂滴表面结构蛋白发现,SFN抑制大鼠肝脏PLIN2和PLIN5 mRNA及蛋白水平表达;FA诱导HHL-5肝细胞10 d,PLIN2和PLIN5表达逐渐上升,SFN从第3 d到第10 d下调PLIN2和PLIN5表达。SFN抑制PLIN2/PLIN5的转录因子PPARγ表达;PPARγ兴奋剂Tro处理HHL-5肝细胞,TG含量上升,PLIN2及PLIN5表达上调。PPARγ兴奋和过表达后,SFN不再抑制PLIN2和PLIN5表达。上述结果提示,SFN不仅降低了脂滴脂肪核心的含量,更是通过抑制PPARγ下调脂滴外周蛋白PLIN2及PLIN5的表达,抑制脂滴形成。FA是合成脂滴脂肪核心的底物,Real-time PCR和Western blot方法检测FA合成相关酶ACC1、SCD1和FAS及其转录因子SREBP1c表达发现,SFN下调其mRNA及蛋白表达。动态观察发现,FA作用24 h后,SFN即下调SREBP1c;FA作用3d后,细胞内TG含量明显减少。ER是合成FA的关键细胞器,肝细胞透射电镜观察发现,SFN可明显修复ER的生理形态,减轻ER肿胀,缩短ER周长;同时改善MT生理形态。内质网应激(ERS)是调控FA合成相关酶的重要途径,Western blot检测发现,SFN下调ERS标志蛋白GRP78表达,降低ERS元件XBP1和PERK的mRNA及蛋白水平表达。采用ERS抑制剂4-PBA处理细胞,XBP1和SREBP1c mRNA表达被抑制,TG含量减少,脂滴形成也明显减少;可见,SFN与ERS抑制剂4-PBA作用类似。综上,SFN通过ERS 两条途径 XBP1-ACC1/SCD1 和 PERK-SREBP1c-FAS 减少脂质积累。ERS发生后,MT与ER形态和功能的变化使二者形成结构偶联区(MAM)。透射电镜观察大鼠肝脏及MT粗提物发现,SFN减轻了肝细胞中MT的膨胀,拉开MT与ER之间的距离,明显下调MAM区连接蛋白PACS2的表达,提示SFN有促进MAM区解体的倾向。SFN明显降低胞浆及MT中Ca2+浓度,从而降低MAM区内通讯信号分子活动。Western blot检测发现,SFN下调ER膜上Ca2+释放通道蛋白IP3R表达和MT内膜上吸收Ca2+的钙离子单向转运蛋白MCU的表达。SFN抑制MAM区中脂滴脂肪核心合成酶DGAT2和ACAT1的表达。高脂摄入严重损害MT的DNA(mtDNA)合成,SFN升高mtDNA表达量,恢复MT膜电位,减少ROS产生,从而减轻MT损伤。SFN提高MT氧化呼吸链中复合物IV的活性,促进ATP合成,改善能量代谢。综上,SFN抑制高脂诱导的肝细胞脂滴形成,其作用机制与抑制ERS,下调MAM区内Ca2+相关蛋白表达、促进MT的氧化磷酸化有关。


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