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基于单细胞表面的人工细胞壁构筑与功能化

苏东悦  
【摘要】:自然界中,大部分的生物细胞的行为与细胞膜和细胞壁的表面紧密相关,细胞行为都直接或间接地由细胞表面与外部环境的界面进行控制或调节。利用化学的方法将细胞表面工程技术引入到细胞表面,为细胞设计一件相容性较好的“纳米人工细胞壁”被认为是具有发展前景的生物技术。在包覆后的细胞中,细胞与人工细胞壁的结合显著地提高了细胞在恶劣环境中的生存能力和稳定性,并扩展了这种细胞核壳结构在细胞催化、细胞传感器、细胞治疗、组织工程等方面的应用。同时,细胞表面的任何变化都会不可避免地导致细胞功能的改变,所以,本论文根据不同细胞模板的需求对人造细胞壁进行了不同的设计合成,通过调控人工细胞壁与细胞内部环境、细胞外部环境的协同作用,来挖掘细胞核壳结构潜在的功能性。具体研究内容如下:以蛋白质微胶囊为包覆模板,通过层层自组装技术将金属螯合复合物(TA-Fe~(3+))人工细胞壁包覆在蛋白质微胶囊表面。在真空干燥的条件下,TA-Fe~(3+)壳层的成功包覆使微胶囊可以维持原有的形状,其包覆前后微胶囊表面的杨氏模量由0.95 GPa增加到1.84 GPa,有效地提高了蛋白质微胶囊表面的机械强度,当外部环境存在蛋白水解酶及小分子还原剂时,这层壳层可以对胶囊起到保护防御的作用,抵抗外环境物质的破坏。通过加入乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA),可以调控人工细胞壁的形成与降解,进而调控蛋白质微胶囊内部装载的DNA进行有效地释放。同时,包覆富集大量电荷的人工细胞壁,可以通过与底物之间的静电作用调控蛋白质微胶囊外膜的透性,进而调节蛋白质微胶囊内部装载碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)的活性。由于人工细胞壁中单宁酸(Tannic acid,TA)的引入,使得TA-Fe~(3+)人工壳层具有一定的抗氧化性,可以有效地消除2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐自由基(2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)~+,ABTS~+)等。通过对无生命的蛋白质微胶囊表面人工细胞壁的构筑研究,为后续在活细胞表面构筑人工细胞壁及功能调控等方面奠定了基础。接下来,选择有生命的酵母细胞为模板进行包覆,结合原位形成团聚体微液滴技术在细胞表面包覆由氨基化的牛血清白蛋白(BSA-NH_2)与羧基化的葡聚糖(Dextran-COOH)构筑的双组分人工细胞壁,通过二乙酸荧光素-碘化丙啶(3,6-Diacetoxyfluoran-Propidium Iodide,FDA-PI)双荧光染色法测试了其团聚体包覆技术对细胞活性的影响可以忽略不计。这层团聚体微液滴人工细胞壁不仅可以保护酵母细胞免受大肠杆菌(E.coli)干扰、抵抗银纳米颗粒(AgNPs)的入侵,而且可以延长细胞的保存时间到2个月以上。此外,该人工细胞壁赋予了酵母细胞一定的捕集能力,使其可以主动地从溶液中捕获营养物质或功能性物质(H_2O_2、Fe_3O_4)等,进而使其包覆后的细胞具有多重功能性。此外,这层由生物分子构成的团聚体壳层可以维持细胞活性,使包覆后的细胞可以继续增殖,并且将团聚体壳层延展到子代细胞,能够保护到第三代子代细胞免受E.coli的干扰。除了该人工细胞壁对包覆细胞的多重保护功能作用外,为进一步探究其与细胞的功能协同性,最后,我们选择了具有光合作用的蛋白核小球藻细胞为模板进行研究,并采用聚多巴胺(Polydopamine,PDA)和漆酶(Laccase)作为构筑基元包覆于细胞表面。当体系中加入底物单宁酸时,单宁酸会快速地吸附在漆酶-聚多巴胺@细胞表面,构筑了一种类似于三明治的夹层结构。特别之处在于漆酶的耗氧反应被夹杂在构筑外层的中间,当消耗光合作用产生的氧气与线粒体呼吸消耗的氧气达到平衡时,使每个小球藻细胞周围处于独立的厌氧环境,从而诱导其细胞由光合产氧转变为光合产氢。并通过调控体系中底物单宁酸的浓度,实现了对包覆后的细胞光合产氧与光合产氢的功能相互转换调控。由于该人工细胞壁对光系统II(photosystem II,PSII)的活性影响很小,从而显著地提高了产氢速率(0.32μmol H_2 h~(-1)(mg chlorophyll)~(-1))及产氢时间(7天)。这一策略也为调节细胞功能和潜在的绿色能源替代发展提供了一条有效的途径。


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