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基于CRISPR/Cas9的一种胞嘧啶碱基编辑器的初步探究

徐登辉  
【摘要】:CRISPR/Cas9技术在目标位点引入双链DNA断裂(DSBs)作为修复基因的第一步,很容易导致基因缺失等突变。因此,研究人员开发了一种新的基因组编辑方法-碱基编辑器。它可以直接将一个碱基或碱基对转换成另一个碱基对,从而在细胞中有效地诱导点突变,此外,CRISPR/Cas9衍生的碱基编辑也提高了修复基因组中点突变的效率。本课题通过将人源的胞苷脱氨酶(AID)分别替代CRISPR/Cas9蛋白中的HNH结构域和RuvC-like结构域,重新设计一种新型的碱基编辑器,检测这种新型碱基编辑器的碱基编辑窗口和编辑效率。首先尝试对碱基编辑器进行体外功能实验,通过将spCas9中的HNH结构域和RuvC-like结构域分别替换为AID蛋白,获得8种dCas9重组质粒,然后在蛋白N端连接上UGI序列,获得dCas9-AID蛋白;同时在体外设计出特定的的sgRNA,通过体外转录纯化等步骤获得100bp的sgRNA;根据sgRNA的序列设计底物DNA序列,通过PCR扩增获得大量的DNA片段。使用原核表达系统体外纯化碱基编辑蛋白,将重组蛋白分别进行GST亲和层析、Ni亲和层析、肝素琼脂糖凝胶层析(Heparin柱)和阴离子交换层析(S柱),对存在紫外吸出的样品进行SDS-PAGE凝胶电泳,将纯化获得的融合蛋白与预先设计好的sgRNA和底物DNA混合,检测碱基编辑器在体外的活性。实验结果显示蛋白未能正确表达,体外功能实验未达到预期目标。然后以pCMV-BE4max为模板改造获得细胞内表达载体,共得到12种不同的重组载体,并通过查阅文献确定FMN1基因为目的位点,根据目的基因序列设计sgRNA并连接着pU6载体中,将构建出的真核表达载体共转入293T细胞中,检测碱基编辑器在体内的功能,通过WB和基因组测序分析,发现碱基编辑蛋白在细胞中能正常表达,将细胞基因组提取后进行PCR扩增,将目的基因片段进行测序,未能检测出蛋白具有碱基编辑的能力。通过本次实验证实了对CRISPR/Cas9蛋白进行结构域的替换是不可行的,可能原因是由于蛋白结构破坏导致蛋白功能异常,无法识别特定位点并进行碱基编辑。


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