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花生基因芯片的分析及鞘脂Δ8去饱和酶基因的功能验证

李昊远  
【摘要】:花生(Arachis hypogaea L.)是我国主要的油料作物和经济作物,产量居世界首位。花生种子的含油量和油脂品质决定了花生的经济价值和营养价值。近年来,与花生油脂代谢相关基因的研究报道不断出现,这些研究将对花生分子育种,品种选育和品种改良具有重要意义。鞘脂作为油脂的一类,是植物细胞膜的重要组分,同时也参与植物抗逆调节。鞘脂Δ8去饱和酶是脂肪酸去饱和酶的一类,通过改变鞘脂的不饱和度参与植物的逆境调控,目前已在拟南芥、烟草等植物中被研究,但在花生中研究较少。基于以上背景,本文的研究主要内容如下:以高油酸中油花生品系F18和低油酸低油的品种鲁花6号作为研究材料,通过表达谱芯片数据分析,发现两品种(系)在30、40、60 DAP时期显著差异表达的基因分别有130、3 556和2 783个;通过维恩图分析,找到两个品种(系)在40和60 DAP共同差异表达的基因1 074个;各时期的GO注释和富集结果都显示,差异表达的基因主要富集在metabolic process(GO:0008152)途径中;KEGG富集结果显示,差异基因显著富集到脂肪酸合成和光合途径中。根据GO注释信息,分别从40和60 DAP两个品种(系)之间差异表达基因中筛选到与油脂代谢相关的基因64和62个。蛋白互作网络分析发现,油脂代谢基因除相互之间有作用外,其还与糖转运以及氧化还原过程等基因有相互作用。以筛选到的鞘脂Δ8去饱和酶基因作为研究对象,从花生中共克隆得到了4个AhSLD基因,分别命名为AhSLD1、AhSLD2、AhSLD3和AhSLD4。序列分析发现,AhSLD1/2/3的开放阅读框均为1 347 bp,AhSLD4为1 359 bp;AhSLD1-4与拟南芥AtSLD1的相似性分别为76%、85%、85%和77%,且都含有b5保守结构域和3个组氨酸保守域结构。花生中4个AhSLD基因的表达特性分析结果显示,4个AhSLD具有明显的组织特异性,且在种子不同发育时期的积累模式不同;在逆境处理下,4个AhSLD对干旱、低温、高盐和ABA处理均有不同程度的响应,其中对干旱刺激最为敏感,AhSLD2/3/4基因的表达量分别比对照上调了21、14和42倍,结果揭示了AhSLD在花生抗逆性中起到重要作用。利用基因工程手段将4个AhSLD基因分别转入酿酒酵母中进行功能验证。结果显示,转入AhSLD的酵母菌与对照相比产生了野生型酵母菌中不存在t18:1鞘脂LCB。研究还发现,不同转基因的酵母菌t18:1鞘脂的转化率不同,且t18:1的顺反异构体的比例不同。转AhSLD1/2/3/4基因的重组酵母菌中t18:1鞘脂LCB的转化率分别为:17.63%、53.50%、23.40%和0.92%。本研究为花生油脂代谢的分子机制提供理论基础,同时也为花生抗逆品种改良贡献了基因资源。


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