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基于产絮克隆菌的遗传及产絮特性研究

常玉广  
【摘要】: 生物絮凝剂作为一种高效、无毒、无二次污染、具有生物可降解性和安全性的绿色水处理剂,代表了絮凝剂的重要研发方向之一。本研究对所分离到的高效絮凝菌进行了菌种鉴定,并对其絮凝特性及代谢成分进行了分析。同时以基因定位为基础,进行了絮凝菌的细胞融合,构建了絮凝菌的基因组文库,得到了具有絮凝特性的克隆菌,并将克隆菌应用到两段式发酵工艺中,即以纤维素降解菌的产物为絮凝菌的发酵原料,进行二段式发酵,获得了新型生物絮凝剂。 经生理生化和16SrDNA分析鉴定,絮凝菌F2为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。通过絮凝活性分布测定,絮凝剂的有效成分存在于发酵液中,为絮凝菌的胞外产物。进一步利用红外光谱、紫外扫描、考马斯亮蓝等手段,确定了生物絮凝剂的有效成分为多糖类物质,具有良好的高效产絮遗传稳定性。为研究产絮菌的遗传特性,采用质粒转化技术进行了絮凝基因的定位实验:将絮凝菌的质粒转入无絮凝特性的大肠杆菌感受态细胞中,得到大肠杆菌阳性转化菌株;经检测,转化菌株无絮凝特性,说明絮凝基因存在于染色体DNA,初步确定絮凝菌质粒无絮凝基因控制。从而确定了絮凝菌的代谢途径,为合成新型、经济的代谢产物及分析代谢产物成分提供了理论基础。 以细胞融合技术作为絮凝菌的改良手段,采用促融合剂聚乙二醇(PEG),进行原生质体的融合,得到融合细胞。通过混凝试验验证,融合细胞的絮凝效果与单菌株一致,表明细胞融合技术作为絮凝菌的改良是有效的、可行的。 为进一步分离和研究絮凝基因,构建了絮凝基因组文库。从文库中筛选出了一株表达絮凝活性的大肠杆菌阳性克隆子FC2,其絮凝率为90%,高于原絮凝菌和受体菌,说明克隆菌FC2絮凝性状遗传于原絮凝菌。采用轻敲模式下的原子力显微镜成像技术、光学显微镜、Zeta(ξ)电位对絮凝微观形貌进行了测定。结果显示,加入克隆菌发酵液的高岭土悬浮液形成的絮凝体出现较大而且紧密的球形颗粒结构,且表面积粗糙,凹凸程度大,具有大的比表面积和吸附液体悬浮颗粒的能力。同时,絮凝颗粒由不定形且松散的结构转变为密集分布、水平尺寸均匀的球形结构,表明克隆菌发酵液中的凝集素容易以高岭土悬浮颗粒为中心吸附在其表面,从更直观上进一步证实了克隆菌发酵液的净水效能。Zeta(ξ)电位测定结果表明,离子键作用强度不同,致使絮凝形态存在着差异,为研究生物絮凝剂的絮凝机理提供了有力的依据。 最后,采用纤维素降解菌和絮凝菌组成的复合型生物絮凝剂产生菌群,进行两段式发酵工艺。以HIT-3的纤维素降解产物作为絮凝菌的代谢底物,得到优良的复合型生物絮凝剂。并研究纤维素降解菌HIT-3的酶学特性,对纤维素酶活进行测定,培养6d达到产酶高峰,酶活力可达到0.676U·mL-1,所产生的有机碳完全能被絮凝菌作为发酵的底物利用,产生的复合型生物絮凝剂的絮凝效果高达94.5%,使生物能源再利用成为可能。


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