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哈茨木霉生物防治相关蛋白酶的基因克隆及功能研究

刘燕  
【摘要】: 哈茨木霉(Trichoderma harzianum)是重要的生物防治菌,能够通过产生水解酶降解植物病原菌的细胞壁,抑制植物病原菌生长,现已开始应用于植物病害的生物防治中。其水解酶的研究对充分发掘哈茨木霉(T. harzianum)的生防潜力有重要意义。以往关于哈茨木霉(T. harzianum)水解酶的研究多集中于几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶,而关于蛋白酶的生物防治功能研究则少有报道。 本文以哈茨木霉(T. harzianum)菌丝体时期诱导cDNA文库为基础,利用SMART RACE技术克隆了哈茨木霉(T. harzianum)枯草杆菌蛋白酶基因sl41、ss10及天冬氨酸蛋白酶基因sa76的cDNA序列及DNA序列。cDNA序列提交GenBank ,序列号分别为DQ910533、EF063644和EF063645。通过生物信息学分析手段对cDNA文库进行筛选,获得了哈茨木霉(T. harzianum)天冬氨酸蛋白酶asp83基因的全长cDNA序列,并登录到GenBank中,登录号为EF063643。 采用Northern blot方法分析了哈茨木霉(T. harzianum)sl41、ss10、sa76和asp83基因在不同植物病原真菌细胞壁诱导条件下和不同饥饿条件下的表达模式。结果表明尽管4条基因彼此之间表达模式有明显差异(如启动表达时间、诱导表达强度等),但是都能够被植物病原菌细胞壁强烈诱导表达。5种病原真菌细胞壁和几丁质均能够强烈诱导sl41、ss10基因表达,且表达不受碳源和氮源的调节。sa76基因能够被病原菌细胞壁和几丁质诱导表达,而且表达受碳、氮饥饿调控。asp83基因表达受氮源的负调控,能够被杨树烂皮病菌(Cytospora chrysosperma)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)3种植物病原菌细胞壁诱导表达。说明这些基因可能在哈茨木霉(T. harzianum)生物防治过程中具有重要作用。 将克隆到的sl41、ss10、sa76和asp83蛋白酶基因分别构建到带有高效启动子的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达载体pYES2上,并成功转入酿酒酵母(S. cerevisiae)H158菌株中。Northern杂交表明蛋白酶基因在酿酒酵母(S. cerevisiae)转录水平表达,SDS-PAGE电泳检测出现单一条带,大小与预期相符,表明蛋白酶成功分泌到胞外。 以酪蛋白为作用底物,通过福林法对转化子发酵液中的蛋白酶进行酶学特性研究。枯草杆菌蛋白酶SL41和SS10酶促反应的最适pH均为8.0,在pH7.5~9.5的范围内保持着较高的酶活;最适酶促反应温度分别为40℃和50℃,SL41在25~30℃范围内对温度变化较敏感;最适酶促反应条件下的酶活分别为19.4U/mL和17.8U/mL。天冬氨酸蛋白酶SA76和ASP83酶促反应的最适pH分别为3.5和4.0,而且它们在pH3~5的范围内保持着较高的酶活;SA76和ASP83的最适酶促反应温度为分别为45℃和40℃;最适酶促反应条件下的酶活分别为11.8U/mL和4.0U/mL。 以5种常见的植物病原真菌,尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、立枯丝核菌(R. solani)、核盘菌(S. sclerotiorum)、链格孢菌(Alternaria alternata)和杨树烂皮病菌(C. chrysosperma)作为供试菌研究哈茨木霉4种离体蛋白酶的生物防治功能。结果表明:4种蛋白酶对5种常见植物病原菌的菌丝生长表现出了不同程度的抑制作用。枯草杆菌蛋白酶SL41和SS10对5种病原真菌均有较强的抑制作用,特别是对尖孢镰刀菌(F. oxysporum )的抑制效果最为明显,菌丝生长抑制率分别为58.22%和47.38%。天冬氨酸蛋白酶ASP83对立枯丝核菌(R. solani)和杨树烂皮病菌(C. chrysosperma)有抑制作用,对其余3种病原菌则几乎无抑制作用。SA76对5种植物病原真菌的生长均有抑制作用,其中对尖孢镰刀菌(F. oxysporum)表现出明显的抑制作用,菌丝生长抑制率为42.11%。


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