磁性高分子微球固定化α-淀粉酶的研究

【摘要】： 磁性高分子微球作为一种新型的高分子功能材料在近几十年得到了充分地发展。特别是磁性高分子微球在固定化酶领域的应用，解决了自由酶易于失活、分离困难、工业上难以应用等难题，使酶催化得以快捷、有效地用于工业大规模生产。制备催化能力强、稳定性好的磁性固定化酶，磁性高分子微球外所包聚合物是关键。我们经过查阅文献发现PF凝胶及聚乙烯醇缩丁醛对酶和蛋白质具有较高的结合能力。本文采用共沉淀法将磁性微球与PF凝胶、聚乙烯醇缩丁醛相结合，制备出磁性PF微球及磁性聚乙烯醇缩丁醛微球，并运用交联法以其作载体固定α-淀粉酶。该类微球未见文献报导。同时运用了X-射线衍射(XRD)、透射电子显微镜(TEM)、红外光谱(IR spectra)、振动样品磁强计、紫外光谱(UR spectra)等多种手段对其进行了表征。主要内容如下： (1)通过大量实验确定了在共沉淀法制备过程中二价铁盐和三价铁盐的浓度、反应温度、沉淀剂浓度、体系pH值等工艺条件，发现二价铁盐和三价铁盐的浓度是影响Fe_3O_4粒子形成的关键因素。控制n(Fe~(2+))：n(Fe~(3+))=2：1，温度：60℃，pH值＞10，反应时间为1h的条件下，所制备的磁性PF微球及磁性聚乙烯醇缩丁醛微球的粒径均一，粒径范围为10～20nm，具有较高的磁响应性，TEM表明其呈微球状。 (2)研究了PF凝胶制备条件、磁性PF微球和磁性聚乙烯醇缩丁醛微球的制备条件及磁性PF微球和磁性聚乙烯醇缩丁醛微球固定化牛血清白蛋白的固定条件等对磁性微球固定蛋白载量的影响。确定PF凝胶的最佳合成条件为：温度：90℃，反应时间：1h，甲醛：30.0mL，对苯二酚：11.0g，盐酸：4mL。当采用如上的制备条件时，所制得的PF凝胶具有较大的蛋白固载量。当PF添加量为2g／0.01mol，pH值等于4，固定时间为3h时，所制磁性PF微球的蛋白固载量最高。制备磁性聚乙烯醇缩丁醛微球的最佳条件为：聚乙烯醇缩丁醛添加量：0.8g／0.01mol，pH：6，固定时间：3h，这时可取得最好的蛋白固定效果。由实验结果可看出，磁性PF微球和磁性聚乙烯醇缩丁醛微球具有较高的蛋白固载量，可作为优良的载体对蛋白质加以固定。 (3)研究了磁性PF微球和磁性聚乙烯醇缩丁醛微球固定化α-淀粉酶的固定条件对磁性固定化酶活性及蛋白载量的影响，确定并比较了自由酶和磁 哈尔滨工程大学硕士学位论文 性固定化酶的最适应用条件、稳定性等理化性质。采用吸附交联法制备磁性 PF微球固定化。一淀粉酶时最佳固定条件为pH:5.n，固定温度:10℃，吸 附时间:Zh，交联时间:4h，叨(戊二醛):0.05%，给酶量:15mL。磁性聚 乙烯醇缩丁醛微球的活化条件为在*(戊二醛)为4%，pH值为6.97的缓冲 溶液中背光振荡4h后静置过夜。固定条件如下:pH:6.07，固定温度:10 ℃，固定时间:3h，戊二醛质量浓度:0.025%，给酶量:巧mL。此时所制磁 性固定化酶有较高的催化活性。 实验结果证明，Q一淀粉酶固定在磁性高分子微球上后，其分子结构没有 改变，仍具有催化活性。比较磁性固定化Q一淀粉酶与自由酶的应用条件可知 磁性固定化酶具有较高的最佳应用温度，对变性剂的抵抗能力大为提高，可 以在更宽的温度范围、pH范围内发挥催化作用，并且在较长时间的贮存后， 固定化酶仍具有较高的活性。此外磁性固定化Q一淀粉酶操作方便，易于与反 应体系分离，可重复使用。因此，我们认为磁性PF微球与磁性聚乙烯醇缩丁 醛微球是两种可用于制备固定化酶的优良载体，将Q一淀粉酶固定在磁性微球 上对。一淀粉酶的工业化应用具有很大的现实意义及实用价值。