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南瓜籽芽蛋白抗氧化肽的酶解条件优化及体外活性的研究

王迪  
【摘要】:黑龙江省南瓜资源丰富,是我国主要的籽用南瓜产地,在南瓜籽油被普遍认为具有保健功效而较多的被人们开发利用的同时,产生的脱脂南瓜籽饼粕这种优质的蛋白资源亟待被深入地研究和开发。而经过发芽的南瓜籽,其油脂和饼粕资源更具功能性,是研究的新方向之一。本文以脱脂后的南瓜籽芽饼粕为原料,经碱溶酸沉法制备南瓜籽芽蛋白,并对其进行双酶分步水解,优化水解条件后得到了南瓜籽芽抗氧化肽粗品,对其抗氧化活性进行评价,最后进行脱盐得到南瓜籽芽抗氧化肽。主要研究结果如下: (1)试验利用碱溶酸沉法制备南瓜籽芽分离蛋白,通过中心复合旋转试验及响应曲面分析得到,影响蛋白提取率的三个因素的主次顺序是液料比、提取温度、提取液pH。最佳提取条件为提取温度40.4℃、液料比为30︰1、pH 10.4,该条件下理论蛋白提取率可达78.52%,而实际测得的蛋白提取率为78.4%(n=3),蛋白纯度为83.42%。 (2)综合还原力和水解度两个指标进行酶的筛选,分析得到碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶是最适合水解南瓜籽芽蛋白的酶,选定此两种酶进行双酶分步水解制备南瓜籽芽抗氧化多肽的试验。通过二次回归正交旋转组合设计实验以及对两个指标的综合衡量,确定双酶分步水解中第一步碱性蛋白酶最佳酶解条件为:底物浓度5%、酶解温度58.5℃、加酶量7133 U/g、酶解液pH 9.54。该条件下还原力和水解度为1.338(n=3)。在此条件下酶解后灭酶,进行第二步水解试验。通过中心复合旋转试验确定第二步木瓜蛋白酶酶解最佳酶解条件为:加酶量4084 U/g、酶解温度52.3℃、酶解液pH 6.53。根据最优化组合的预测值进行验证,结果还原力为1.531(n=3)。第二步水解后比第一步水解所得还原力提高了14.42%。 (3)试验测定了南瓜籽芽抗氧化肽粗品的抗氧化活性。得到南瓜籽芽抗氧化肽粗品的还原能力、自由基清除能力都随着多肽浓度的增加而增强,在一定范围内呈量效关系。所得抗氧化肽粗品浓度为20 mg/mL时的还原力可达0.841,略高于BHA(0.001%)的还原能力(OD值0.835);当南瓜籽芽抗氧化肽粗品的浓度为30 mg/mL时的还原力为1.097,高于0.2 mg/mL VC的还原能力(OD值0.945);南瓜籽芽抗氧化肽粗品对超氧阴离子自由基、羟基自由基以及DPPH·自由基的IC_(50)分别为6.36 mg/mL,6.55 mg/mL,5.42 mg/mL。 (4)试验选择大孔吸附树脂进行脱盐,脱盐率为92.37%,抗氧化肽的回收率为90.26%。脱盐后的抗氧化肽浓度为10 mg/mL时,还原力比未脱盐时提高了12.13%;脱盐后的南瓜籽芽抗氧化肽对超氧阴离子自由基的半抑制浓度比未脱盐时降低了10.82%;对羟基自由基的半抑制浓度比未脱盐时降低了14.96%;对DPPH·自由基的半抑制浓度比未脱盐时降低了8.3%。


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