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与PRRSV NSP9相互作用的宿主蛋白的筛选与鉴定

郭东伟  
【摘要】:猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是20世纪80年代末出现的一种严重引起怀孕母猪繁殖障碍和各年龄猪呼吸道症状为特征的一种传染病,目前该病已经被OIE索引列为B类传染病,在我国也被列为动物检疫二类传染病,是严重危害世界养猪业的病毒性传染病。PRRSV NSP9基因编码依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp),在PRRSV复制过程中,由某些宿主蛋白和NSP9组成的膜相关的病毒复制转录复合体(RTC)可以调控病毒基因组的转录和亚基因组mRNA的合成,是病毒RNA复制的起始与核心,因此NSP9与某些宿主蛋白的变化很可能会影响病毒的复制和转录效率,而病毒蛋白与宿主蛋白之间的相互作用在参与病毒基因组复制过程中的机理尚不明确。 本研究成功构建了猪肺泡巨噬细胞(PAM)cDNA酵母表达文库,并将PRRSV-HuN4NSP9的基因片段克隆到酵母诱饵载体pGBKT7中,经过对诱饵蛋白自激活及毒性检测后,与PAM cDNA酵母表达文库进行杂交,筛选得到与PPRSV NSP9相互作用的宿主蛋白。通过对不同营养缺陷型培养基的筛选,获得了20个阳性克隆,经测序比对分析后,最终获得两个宿主蛋白即:蛋白激酶C1受体(receptor of activated protein kinase C1,RACK1)和膜连蛋白A2(Annexin A2),之后我们选择了可能与病毒复制相关的Annexin A2蛋白做进一步深入研究。经免疫共沉淀试验和激光共聚焦试验验证,AnnexinA2与NSP9存在特异性结合,并共定位于细胞浆和细胞膜上。研究结果表明,宿主蛋白Annexin A2是PRRSV NSP9新的相互作用蛋白,而AnnexinA2参与PRRSV复制的详细机理还有待进一步深入研究。


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