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基于~1H NMR和GC/MS技术的奶牛酮病血浆代谢组学分析

孙玲伟  
【摘要】:奶牛酮病是多发于围产后期的一种代谢性疾病。通常是因为奶牛产后进行大量泌乳和/或糖类等能量物质摄入不足所致的能量负平衡而无法有效缓解,促发本病。酮病因造成奶牛生产性能、繁殖性能下降,给奶牛场来了巨大损失,而受到奶牛业的高度重视。以往大多是针对奶牛酮病的发生机理、生化和病理的单一研究,未见系统的代谢组学研究,因此本实验将阐明奶牛临床和亚临床酮病发生中机体全景式的代谢变化,这对丰富和发展酮病的病因学和防治具有重要的理论意义。 通过应用代谢组学技术平台对奶牛酮病的血浆样品进行检测,之后再结合多元统计分析方法,剖析奶牛临床酮病和亚临床酮病机体内源性代谢物的变化,阐明差异表达的特征代谢物,分析酮病奶牛机体代谢异常改变,为进一步探究奶牛酮病发生新机制和新防治策略提供依据。 本研究中选取产后7-21天泌乳荷斯坦奶牛作为试验动物,根据血浆β-羟丁酸(BHBA)和临床症状采集80头实验奶牛血浆样本,临床酮症组奶牛(CK,n=24头)产后表现出明显的临床症状和血浆β-羟丁酸(BHBA)浓度1.60mmol/L,亚临床酮病组奶牛(SK,n=33头)产后无临床表现和血浆BHBA浓度1.20mmol/L;健康对照组奶牛(C,n=23头)产后无任何临床症状和血浆BHBA浓度1.00mmol/L。所选取的实验动物除酮病外无其他伴发和继发的疾病。运用生物核磁共振技术平台(1H Nuclear Magnetic Resonance,1H NMR)和气相色谱-质谱联用技术平台(Gas Chromatography/Mass Spectrometry,GC/MS)检测三组奶牛血浆代谢产物,结合主成分分析和偏最小二乘法等多元统计方法进行分析。最后,应用生物信息学技术对差异代谢物进行生物学分析。 应用1H NMR技术平台进行检测,将临床酮病组、亚临床酮病组与健康对照组相比,差异性代谢物均为23个,其中增高的代谢物主要有β-羟丁酸、乙酰乙酸、丙酮和乙酸等,降低的主要有乳酸、组氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸和葡萄糖等;而临床酮病组和亚临床酮病组中差异性代谢物为28个,其中增高的主要有β-羟丁酸、乙酰乙酸和丙酮等,降低的主要有柠檬酸、甲酸、组氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、和极低密度脂蛋白等。通过GC/MS分析,共检测出267个变量,组间种类无差别代谢物为40种。与对照组相比,临床和亚临床酮病差异代谢物均为32个,其中增高的主要有β-羟丁酸、α-氨基丁酸、谷固醇、异亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸和十四酸、十六酸、等脂肪酸,降低的主要有葡萄糖、乳糖、乙醛酸、丙氨酸、焦谷氨酸、乳酸等;临床酮病与亚临床酮病组相比有13个差异代谢物,其中增高的主要有十七酸、十八酸和3-羟基戊酸等,降低的主要有脯氨酸、丝氨酸、α-氨基丁酸和3,4-二十二碳六烯酸等。通过寻找Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)数据库分析代谢物,这些代谢物主要参与氨基酸代谢、脂肪代谢和碳水化合物代谢等能量代谢密切相关,也参与了酮体的生成。 研究结果显示应用1H NMR与GC/MS联用技术,并结合模式识别分析技术,能够有效地获得区别奶牛临床酮病和亚临床酮病的差异性代谢物,而其中对分类有贡献的差异代谢物可能是奶牛酮病诊断的潜在代谢标记物和客观指标;并全景式地揭示了酮病发生过程中机体发生了广泛的代谢紊乱,为今后深入探究酮病发生机理和新的防治策略奠定了基础。


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