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重组OmpA基因工程菌培养条件优化及遗传稳定性研究

李艳坤  
【摘要】:大肠埃希菌是引起奶牛乳房炎常见的革兰氏阴性条件性致病菌,近年来有关大肠埃希菌引起奶牛乳房炎的报道越来越多。由于大量耐药菌株的产生使抗生素治疗奶牛乳房炎效果不佳,因而促使人们研究和使用疫苗免疫接种加以防治。以往研究表明,重组OmpA(rOmpA)免疫接种小鼠能够诱导良好的抗大肠埃希菌感染免疫应答和免疫保护作用,并对志贺氏菌及克雷伯氏菌感染具有交叉免疫保护作用,是颇有潜力的疫苗候选抗原。但表达rOmpA的基因工程菌遗传稳定性和诱导表达条件等尚需研究确定,为大规模生产预防大肠埃希菌性奶牛乳房炎rOmpA基因工程亚单位疫苗提供依据。试验首先对表达rOmpA基因工程菌的培养初始pH值、接种量、震荡培养转速、诱导剂浓度等单因素条件进行优化。结果,表达rOmpA的基因工程菌在培养时,初始pH值为7-8、接种量为1%、振荡培养转速为160-180 r/min、诱导剂浓度为0.1 mmol/L为最佳培养条件。试验再将工程菌株传至50代后,取第0、5、10、15、20、25、30、40、50代培养物,对表达rOmpA的基因工程菌的菌落及菌体形态特性、生长规律、基因变异、表达产物等进行检测分析,以确定该基因工程菌株的遗传稳定性。结果,表达rOmpA的基因工程菌传至50代时,仍然保持与原代工程菌的菌落、菌体大小及形态相一致,生长曲线无明显不同;表达载体的双酶切鉴定结果为5900 bp和1041 bp两条电泳带,与传代初的表达载体双酶切结果一致,编码rOmpA的基因序列与传代初的工程菌同源性100%;以SDS-PAGE凝胶电泳及免疫印迹检测表达产物,表达分子量约56 kD的蛋白质,与传代初初的工程菌一致。以上结果证明表达rOmpA的基因工程菌具有良好的遗传稳定性。


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