鲁氏酵母通过谷胱甘肽代谢途径响应D-果糖胁迫的分子机制研究

【摘要】：鲁氏酵母菌(Zygosaccharomyces rouxii)是一种常见的发酵微生物,前期研究发现,在含有120 g/L D-果糖和180 g/L NaCl的YPD培养基中,鲁氏酵母可以代谢合成较高产量的4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮(HDMF)食品风味物质。在这种糖/盐双重渗透压下,探索鲁氏酵母在发酵早期阶段的胁迫应答,揭示其抗性机制具有重要的理论和应用研究价值。为了探讨在D-果糖胁迫下鲁氏酵母的抗性机制,进行了D-果糖胁迫下鲁氏酵母生理生化指标、抗氧化酶活及基因表达、谷胱甘肽代谢通路多组学研究,并对关键酶谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)进行生物信息学分析,从转录组学-蛋白组学-代谢组学的角度探讨了鲁氏酵母通过谷胱甘肽代谢途径响应D-果糖胁迫的分子机制。试验结果如下:(1)D-果糖胁迫下鲁氏酵母生理生化指标研究结果:YPD+Fru组中酵母活细胞数量和细胞面积在发酵初期显著低于YPD组(p0.01),后期则高于对照组(p0.001)。外源D-果糖在发酵初期对鲁氏酵母有胁迫作用,随着发酵时间的延长,它不再是鲁氏酵母的胁迫物质,成为营养物质促进鲁氏酵母的生长。(2)D-果糖胁迫下鲁氏酵母抗氧化能力及抗氧化酶基因表达结果:在发酵期间,YPD+Fru组的MDA含量和细胞膜相对电导率均高于YPD组。而且YPD+Fru组细胞表现出较低的抗超氧阴离子自由基能力。YPD+Fru组的过氧化氢酶(CAT)酶活始终高于对照组。除其他酶活外,在发酵1 d时仅GSH-Px的活性显著增加(p0.001)。GSH-Px基因在D-果糖胁迫条件下表达水平高于对照组。结合转录水平和酶活性结果,在整个发酵过程中,GSH-Px是主要防御酶,而CAT是持续防御酶。(3)谷胱甘肽代谢通路多组学分析结果:谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸生物合成途径中的关键基因和参与谷胱甘肽合成的关键基因均显著上调。除丝氨酸转羟甲基酶(SHMT)外,其他基因的蛋白质组学表达水平与qRT-PCR结果一致。培养基中D-果糖含量随发酵时间进行逐渐降低,谷胱甘肽代谢途径中最重要的中间代谢产物——γ-谷氨酰半胱氨酸和谷胱甘肽酰胺含量始终高于YPD组。YPD+Fru组中合成谷胱甘肽的代谢通量增加。(4)GSH-Px生物信息学分析结果:以NCBI数据库中鲁氏酵母GSH-Px基因序列为基础进行生物信息学分析,该基因全长624 bp,编码区具有207个氨基酸,蛋白相对分子量预测为23120.84 Da,为亲水蛋白,无跨膜区,无信号肽。综上所述,鲁氏酵母在D-果糖胁迫下,抗氧化相关酶的活性明显提高,通过多组学分析明确了谷胱甘肽代谢途径中关键酶基因发生差异表达,从而促进细胞中合成谷胱甘肽以抵抗氧化应激。