外源D-果糖促进鲁氏酵母合成呋喃酮碳代谢的分子机制研究

【摘要】：鲁氏酵母(Z.rouxii)是豆酱和酱油酿造体系的优势菌,可以在发酵过程中把糖类物质转化成有机酸、醇和其他风味代谢产物并产生芳香族化合物。其中4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮(HDMF)和4-羟基-2乙基-5甲基-3(2H)-呋喃酮(HEMF)作为鲁氏酵母重要的香气来源,也是酱油和豆酱当中的主要香气物质,但是其代谢机制尚不清楚。前期研究发现,添加D-果糖可促进鲁氏酵母高产呋喃酮,因此明确外源D-果糖调控鲁氏酵母合成HDMF和HEMF的碳代谢机制,有助于为鲁氏酵母生物合成食品呈香化合物细胞工厂创制提供理论依据。本文通过研究鲁氏酵母外源添加D-果糖对HDMF和HEMF生物合成过程中不同发酵时期的基因的表达量、酶调控作用及其代谢物变化,并利用HPLC对HDMF和HEMF进行定量分析,应用酶学方法在蛋白水平进行共同论证,并结合转录组学和代谢组学从分子角度进一步揭示其代谢机制,为呋喃酮的生物合成提供了新的理论基础。研究结果如下:(1)利用Illumina HiSeqTM高通量测序平台对外源添加D-果糖的鲁氏酵母进行转录组测序,分别获得了不同发酵时期的Clean reads,采用HTSeq软件对各样品进行基因表达水平分析,通过hmmscan得到新基因的GO注释文件。通过KEGG分析发现鲁氏酵母具有完整的糖酵解(EMP)、磷酸戊糖途径(PP)和三羧酸循环(TCA)碳代谢途径。FBA和6PGDH分别是调控呋喃酮前体物质磷酸二羟丙酮(DHAP)和核酮糖-5-磷酸合成的关键基因。(2)通过添加D-果糖对鲁氏酵母的生长特性及呋喃酮含量变化进行研究发现,在YPD培养基中添加D-果糖的鲁氏酵母生物量是未添加D-果糖的2.5倍,且菌落生长状态良好。添加外源D-果糖明显增加了鲁氏酵母中HDMF和HEMF的产量,发酵5 d时HDMF达到98 mg/L、HEMF达到25 mg/L,同时提高了其产酸和产酮的能力。说明添加D-果糖更利于鲁氏酵母的生长和风味物质的合成。(3)通过实时荧光定量PCR技术检测EMP和PP途径中合成呋喃酮前体物质相关基因表达量的变化,探究外源添加D-果糖对鲁氏酵母产呋喃酮转录水平的影响。结果显示,与呋喃酮合成正相关的HK、PFK1、G6PI、FBA、TPI、6GPL、TKT和6PGDH的表达量均有明显差异,主要起到正调控作用,说明这些基因可能在酶促催化反应和自发化学转化过程中促进呋喃酮合成。(4)通过GC-MS法检测与呋喃酮合成相关的代谢产物变化,发现在YPD培养基中添加D-果糖的鲁氏酵母利用果糖-1,6-二磷酸和核酮糖-5-磷酸等与呋喃酮合成相关的代谢物增多,产量增加,且有机酸,酯类风味代谢物也增多。进一步在代谢水平说明外源添加D-果糖能提高鲁氏酵母生物合成呋喃酮。通过生物信息学分析FBA基因结构,基因全长1086 bp,编码361个氨基酸,为亲水蛋白,属于非跨膜蛋白。含有较多的磷酸位点,α-螺旋和无规则卷曲是FBA蛋白的主要结构元件。