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一种赤子爱胜蚓体腔液蛋白的分离纯化及其生物活性的初步研究

张阳  
【摘要】: 赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)体腔液中含有众多具有生物学功能的蛋白质,分离纯化单组份蛋白并研究其生物学活性具有重要的意义。目前,已经发现了几种具有抗菌和溶血活性的蚯蚓体腔液蛋白,然而,蚯蚓腔液中蛋白质种类繁多,特别是对赤子爱胜蚓体腔液免疫活性蛋白知之甚少。本研究以赤子爱胜蚓为研究对象,从其体腔液中分离纯化出一种具有免疫活性的蛋白质,并对其生物学活性进行了初步研究。 依次采用超滤,凝胶层析和离子交换层析的方法,从赤子爱胜蚓体腔液分离纯化得到一种蚯蚓体腔液蛋白(Eisenia foetida Coelomic Fluid Protein,ECFP),经SDS-PAGE判定为凝胶级纯度。理化指标检测发现,ECFP的分子量为38.6 kDa,最大紫外吸收波长为278 nm,该蛋白带有正电荷。10批次ECFP样品蛋白平均浓度为0.349 mg/mL,平均pH值为7.95,茚三酮反应、双缩脲反应和磺基水杨酸反应均显阳性。 对ECFP的生物学活性研究结果如下: 1.采用比浊法和牛津杯法检测ECFP对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用:比浊法结果显示,低浓度的ECFP对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均呈现抑制趋势,作用大肠杆菌1 h后出现抑制效果,作用金黄色葡萄球菌3 h后出现抑制效果,表现为时效性差异。而牛津杯法检测结果表明,ECFP作用于金黄色葡萄球菌24 h后出现抑菌圈,当ECFP浓度分别为0.32 mg/mL、0.16 mg/mL和0.08 mg/mL时,抑菌圈直径分别为13.2 mm、12.2 mm和11.0 mm,但作用大肠杆菌没有观察到明显的抑菌圈。 2.不同浓度的ECFP作用鸡红细胞检测溶血活性:结果显示,ECFP对鸡红细胞具有明显的溶血活性,ECFP溶解鸡红细胞的最低浓度为0.19μg/mL。倒置显微镜下观察发现,高浓度的ECFP作用鸡红细胞后,细胞发生溶胀变形。 3.应用MTT法检测ECFP对体外培养的人宫颈癌Hela细胞株和人肺癌LTEP-α-2细胞株生长抑制作用:Hela细胞和LTEP-α-2细胞在浓度为0.16、0.08、0.04、0.02和0.01 mg/mL的ECFP分别作用24、48、72和96 h后检测发现,ECFP对两种癌细胞的抑制率均显著升高。对两种细胞的抑制率进行方差分析结果发现,随着ECFP作用浓度的增加,两种癌细胞的抑制率升高极其显著(P0.01),呈浓度依赖性。随着ECFP作用时间的延长两种癌细胞抑制率也显著升高(P0.05),呈时间依赖性。倒置显微镜下观察Hela细胞和LTEP-α-2细胞在浓度为0.16、0.08、0.04、0.02和0.01 mg/mL的ECFP作用72 h的形态变化发现,Hela细胞随着ECFP浓度的增加细胞贴壁能力下降,细胞破裂坏死。LTEP-α-2细胞随着ECFP浓度的增加细胞贴壁能力下降,细胞内出现大小不一的空泡,细胞破裂坏死。 4.腹腔注射不同浓度的ECFP检测小鼠体温的变化:分别注射浓度为0.16、0.08、0.04、0.02和0.01 mg/mL的ECFP 0.1 mL,在注射后0、24、48、72和96 h检测体温变化结果显示,随着ECFP浓度的增加小鼠的体温变化不显著(P0.05),随着作用时间的延长小鼠的体温变化也不显著(P0.05)。小鼠饮食、饮水和精神状况良好没有发生不良反应,说明腹腔注射ECFP对小鼠的体温变化无显著影响。 此外,在确定ECFP生物活性后,我们采用正交试验L9(3)4设计,分离提取了蚯蚓组织匀浆液蛋白,其抑菌活性结果表明,蚯蚓组织匀浆液同样具有一定的抑制金黄色葡萄球菌生长的作用,说明蚯蚓组织匀浆液中也含有抗菌蛋白活性成分。


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