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抗蓖麻毒素单链抗体的构建、表达、纯化及功能测定

纪秋野  
【摘要】: 本实验从分泌抗蓖麻毒素(Ricin)单克隆抗体的杂交瘤细胞4D12中,提取细胞总RNA,在反转录酶的作用下,反转录成cDNA。设计引物,从cDNA中PCR扩增出抗蓖麻毒素单克隆抗体的轻、重链可变区基因VL、VH,将VL、VH基因分别加入Linker片段,改造后得到VL′、VH′基因。利用重叠延伸PCR法(SOE-PCR)将VL′、VH′组合成SvFv形式。将ScFv基因克隆入pMAL-p2X表达载体中,进行核苷酸序列分析测定。测序结果表明:VL基因与小鼠免疫球蛋白κ链v-v区基因对比相似率达91%、VH基因与小鼠球红霉素重链可变区基因对比相似率达93%,表明克隆得到的基因为功能性重排的小鼠抗体可变区序列。ScFv基因全长为750bp,其中VL基因为324bp,编码108个氨基酸;VH基因为363bp,编码121个氨基酸。在VL与VH之间为45bp的Linker序列,与设计完全相符。 构建的pMAL-RT-ScFv重组质粒,转化大肠杆菌TB1感受态,经IPTG低温诱导后,重组蛋白得到高效表达,而且为可溶性蛋白。经SDS-PAGE鉴定,表达的可溶性蛋白位于约73kDa处,与理论值相符。融合蛋白经Amylose直链淀粉亲和层析柱纯化,Western-blot检测,得到一条抗蓖麻毒素单链抗体基因表达蛋白的特异性条带。经酶联免疫吸附法及表面等离子共振技术测定其与蓖麻毒素的结合活性,结果显示pMAL-RT-ScFv可溶性蛋白具有与蓖麻毒素特异性结合的活性。 本文采用RT-PCR的方法,从分泌抗蓖麻毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞4D12中得到抗体轻、重链可变区基因。利用SOE-PCR的方法将其拼接为ScFv形式,并在pMAL-p2X表达系统中进行了表达。成功构建了有蓖麻毒素结合活性的ScFv基因,为蓖麻毒素的应用、蓖麻饼粕中残留毒素导致机体中毒及机体中毒后的治疗和蓖麻饼粕的脱毒等相关问题的研究,奠定了良好的理论基础。


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