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尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG):人参皂苷Rh_2葡萄糖基转移酶(UGRh_2GT)的纯化与生化特性的研究

何彦平  
【摘要】: 糖基转移酶普遍存在于植物细胞中,在植物次级代谢产物生成过程中糖基转移酶将核苷二磷酸活性糖分子通过糖苷键连接到小分子底物上。人参属植物三七中的人参皂苷Rd葡萄糖基转移酶的研究已有报道,而人参属植物中其它人参皂苷葡萄糖基转移酶还没有报道,因此对人参皂苷Rh2葡萄糖基转移酶的研究具有创新性。糖基转移酶在人参皂苷代谢的后修饰阶段起重要的作用,为此研究人参培养细胞中的人参皂苷Rh2葡萄糖基转移酶对阐明人参皂苷Rg3的生物合成提供信息,并对人参皂苷Rg3生产的调控提供参考。 本试验,用人参种胚为外植体诱导愈伤组织并建立悬浮细胞系,并以此悬浮细胞作为研究糖基转移酶的材料。以人参悬浮细胞酶提取液为酶制剂、人参皂苷Rh2为底物、UDPG为葡萄糖供体检测尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG):人参皂苷Rh2葡萄糖基转移酶(UGRh2GT)活性。采用高效液相色谱法(HPLC)测定反应产物。用二次D-饱和最优设计优化酶活测定体系的温度和pH值。通过对酶提取液进行硫酸铵沉淀、疏水层析及离子交换层析,分离纯化UGRh2GT。用SDS-PAGE对纯化的UGRh2GT进行纯度检测及分子量估算;使用Lineweaver和Burk法,测定UGRh2GT对人参皂苷Rh2的表观Km和Vmax;检测EDTA、NH4+及常见金属离子对UGRh2GT活性的影响;同时分别以人参皂苷Rd和苷元原人参二醇为底物检测UGRh2GT的转化能力。 我们在人参悬浮细胞酶提取液中检测到尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG):人参皂苷Rh2葡萄糖基转移酶(UGRh2GT)活性。检测人参细胞中UGRh2GT催化人参皂苷Rh2生成Rg3的最佳温度为34.1℃,最优pH值是9.3。疏水层析色谱将人参悬浮细胞提取液中的UGRh2GT纯化了9.6倍。收集疏水层析色谱纯化的UGRh2GT用于离子交换层析色谱。离子交换层析色谱将UGRh2GT纯化了43.7倍。对离子交换层析纯化后的UGRh2GT进行SDS-PAGE,只观察到了一条蛋白带,分子量为55kDa。UGRh2GT对人参皂苷Rh2的Km值是0.2mM,对人参皂苷Rh2的Vmax为3.33nkat/mg。对UGRh2GT酶活有促进作用的离子有Na+, K+,Li+ ,NH4+,EDTA2+,Co2+Ba2+,Ca2+,Mg2+和Mn2+,其中Li+的促进作用最大;对酶活有抑制作用的离子有Ag+ ,Fe2+,Zn2+,Hg2+和Cu2+,其中Zn2+和Hg2+的抑制作用最强。UGRh2GT不能将人参皂苷Rd糖基化为Rb1,也不能将苷元原人参二醇糖基化成人参皂苷Rh2或Rg3,因此UGRh2GT对底物具有一定的选择性。


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