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苏云金芽胞杆菌新型vip3基因克隆、表达及活性分析

何晓明  
【摘要】:农业害虫的危害一直都是我国农业面临的重大难题。我们长期以来大量施用化学农药防治农业害虫。然而由于化学农药的滥用,给人类的健康和环境造成了巨大威胁,同时害虫产生了抗药性,导致田间用药量不断增加,不仅防治成本大幅度的提高,对环境的污染也进一步加重。生物防治是解决这些问题的有效途径之一。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)因其杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的杀虫微生物。具有杀虫活性主要是因为其产生多种具有杀虫活性的蛋白质,如杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins, ICPs)和营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal proteins, VIPs)。 VIPs是一类在营养期分泌的新型杀虫毒蛋白,与任何已知的杀虫晶体蛋白没有同源性,其杀虫机理也不同于已知的杀虫晶体蛋白。VIPs蛋白单独或是与Cry蛋白协同作用,以及组建融合基因构建工程菌,都可以扩大Bt杀虫谱,同时可以抑制害虫抗药性的产生。 本研究对72株苏云金芽胞杆菌标准菌株进行vip3类基因型的鉴定,PCR鉴定呈阳性的有18株。利用高分辨熔解曲线(high resolution melting, HRM)检测PCR产物,由于扩增产物的碱基组成不同,不同类型的基因产生不同的熔解曲线,从而对所含有的vip3基因进行了分型。经熔解曲线类型分析,18株阳性菌株中的vip3基因大致分为8种类型。该方法可以高通量地进行基因分型,特别是可以同时检测出已知和新型的vip3类基因。根据已知vip3基因序列设计了PCR引物,成功克隆了五个vip3基因。提交至GeneBank并被国际Bt命名委员会正式命名为vip3Aa38、vip3Aa39、vip3Af3、vip3Ag3和vip3Ba2。 将vip3基因全长片段插入表达载体pEB中,低温条件下在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行IPTG诱导表达,表达产物为88kDa左右的蛋白。将表达的蛋白进行了对小地老虎、小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾四种鳞翅目昆虫的生物活性测定。Vip3Aa39蛋白对四种昆虫具有较高的毒力。Vip3Aa39蛋白与本实验室此前获得的Vip3Aa11蛋白进行比较,发现两者存在39个氨基酸的差异。用两种蛋白的表达产物分别进行了对小地老虎、小菜蛾、棉铃虫和甜菜夜蛾的杀虫活性测定,结果表明Vip3Aa39对小地老虎有较高的杀虫活性,LC50为5.43μg/ml,而Vip3Aa11的LC50为73.62μg/ml;Vip3Aa39对小菜蛾具有较高的杀虫活性,LC50为140.64μg/ml,而Vip3Aa11对小菜蛾杀虫活性极低;Vip3Aa11对棉铃虫具有较高的杀虫活性,LC50为35.18μg/ml,而Vip3Aa39的LC50仅为286.99μg/ml;Vip3Aa39和Vip3Aa11均对甜菜夜蛾具有高毒力,LC50分别为2.02μg/ml和2.04μg/ml。以上结果说明Vip3Aa39与Vip3Aa11对小地老虎、小菜蛾、棉铃虫的杀虫活性具有显著不同。


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