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黑曲霉β-甘露聚糖酶基因的克隆及其原核和真核表达

张旭  
【摘要】:β–甘露聚糖酶(endo-1,4-β-D-mannanase;mannohydrolase;EC3.2.1.78)是一类能够水解甘露寡糖、甘露多糖(包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘聚糖等)中的1,4-β-D-甘露糖苷键的内切水解酶,属于半纤维素酶类。目前β–甘露聚糖酶己在食品、医药、造纸、纺织印染、石油开采及生物研究技术等多方面得到广泛运用,黑曲霉是工业化生产甘露聚糖酶的主要菌种,但是目前的生产菌种存在发酵过程中产生大量孢子、发酵周期短、发酵条件难以控制、酶产量低等缺点。利用基因工程方法构建甘露聚糖酶工程菌,简化发酵条件,增加酶的产量,具有重要的研究价值。 本研究以甘露聚糖酶基因生产菌种黑曲霉为基因供体,克隆甘露聚糖酶基因(MAN),构建其大肠杆菌表达载体、毕赤酵母表达载体和黑曲霉表达载体,并分别转到大肠杆菌BL21、毕赤酵母GS115和糖化酶生产菌种黑曲霉中,为简化甘露聚糖酶的发酵条件,增加酶的产量探索新的途径。 主要研究成果如下: 1.MAN在大肠杆菌中的表达 以β-甘露聚糖酶生产菌黑曲霉为材料,通过RT-PCR扩增获得β-甘露聚糖酶基因MAN的cDNA片段。构建了MAN基因的大肠杆菌表达载体pET-MAN。酶切鉴定正确后,将该载体导入大肠杆菌BL21。重组菌株经IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE,在菌体裂解物上清得到62 KD的融合蛋白条带,表明黑曲霉β-甘露聚糖酶在大肠杆菌中表达成功。用DNS法的测定不同温度、不同pH下菌体裂解物上清中的甘露聚糖酶活性,结果表明重组甘露聚糖酶的最适温度为55℃,最适pH为5.5,在此的条件下,甘露聚糖酶活力为48 IU/mL。 2.MAN基因在毕赤酵母中的表达 以MAN的cDNA片段为模板,通过PCR扩增获得去除自身信号肽序列的MAN基因片段。构建了由GAP启动子调控、带有改造后的α信号肽序列的MAN基因毕赤酵母表达载体pGAPHα-MAN。酶切鉴定正确后,将载体线性化并通过电击转化毕赤酵母GS115。经PCR鉴定得到重组子。 3.MAN基因在黑曲霉中的表达 以β-甘露聚糖酶生产菌黑曲霉为材料,通过PCR扩增获得β-甘露聚糖酶基因MAN的基因组序列。以糖化酶生产菌黑曲霉为材料,通过PCR扩增获得Gla基因5'和3'同源臂的DNA片段。通过重叠延伸PCR的方法将MAN,Gla5',Gla3'三个片段连接在一起构成MAN基因同源重组表达框GMG。进一步构建了MAN基因黑曲霉表达载体pSZH-MAN。 pSZH-MAN质粒通过冻融法转入农杆菌EHA105中,与糖化酶生产菌黑曲霉共培养。筛选转化子,获得重组甘露聚糖酶的工程菌。重组菌株经诱导表达,将表达产物进行SDS-PAGE,并用DNS法的测定该蛋白的甘露聚糖酶活性。


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