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谷胱甘肽过氧化物酶3在小鼠围着床期子宫中的表达、调节与功能

许袖  
【摘要】:胚胎着床和蜕膜化对于整个妊娠过程是至关重要的步骤,这些妊娠早期事件的异常可能是辅助生殖技术的主要限制因素。动物细胞进行有氧代谢产生活性氧,活性氧既影响生殖系统的正常功能,也在一些不孕症的发病机理中起作用。抗氧化酶能够清除活性氧,维持氧的平衡状态。谷胱甘肽过氧化物酶是非常重要的一类抗氧化酶。基于我们前期的基因芯片分析结果,与非着床点相比,Gpx3在小鼠的胚胎着床位点显著上调,暗示Gpx3可能在小鼠胚胎着床过程中起作用。但到目前为止,关于Gpx3在小鼠胚胎着床过程中的表达、调节及功能仍不清楚。本研究利用原位杂交、Real-time RT-PCR、Western Blot和荧光素酶分析等方法,对Gpx3在小鼠子宫内膜中的表达、调节和功能进行探讨。 利用原位杂交发现,在早期妊娠第1-4天的子宫中和第5天子宫的非着床位点处Gpx3 mRNA没有表达。在第5天子宫的着床位点处胚泡周围的基质细胞中以及第6-8天子宫的蜕膜区中,Gpx3 mRNA表达很强。在假孕小鼠第1-5天的子宫中,Gpx3 mRNA没有表达。在延迟着床激活的子宫中,Gpx3 mRNA也呈现特异性表达,与早期妊娠第5天的着床位点处表达相似。在人工诱导蜕膜化子宫的蜕膜区,Gpx3 mRNA表达也很强。利用Real-time RT-PCR的方法也进一步验证了Gpx3 mRNA在小鼠早期妊娠子宫内膜中的表达,而且与GPX家族的其它成员相比,Gpx3 mRNA的表达变化更加明显,表明它在妊娠小鼠的子宫中可能发挥主要作用。在卵巢切除小鼠的激素处理模型中,雌激素处理72?h时Gpx3 mRNA显著上调,孕酮处理12 h时Gpx3 mRNA显著上调,而且PR的抑制剂RU486能够抑制孕酮诱导的Gpx3上调。 在妊娠第4天的小鼠子宫内膜基质细胞中,孕酮通过PR/HIF1α上调GPX3,而PR的抑制剂RU486或HIF1α的抑制剂Chrysin能够抑制这种上调作用。此外,8Br-cAMP也能上调小鼠子宫内膜基质细胞中Gpx3 mRNA的表达,而亚硒酸钠能够以转录后调节的方式上调GPX3蛋白的表达。利用荧光素酶分析发现,miR-138能够显著降低野生型Gpx3的3′-UTR报告载体的活性。如果miR-138的结合位点发生突变,miR-138则不能抑制报告载体的活性。另外,miR-138还能抑制小鼠子宫内膜基质细胞中GPX3蛋白的表达,因此Gpx3是miR-138的靶基因。 本研究发现,子宫内膜中的H2O2在第5天着床点的含量显著低于第5天非着床点的含量,并且Gpx3 mRNA和蛋白在第5天着床点比非着床点都显著上调。由Real-time RT-PCR结果看出,GPX家族的其它基因在第5天着床点却没有很明显的上调,表明GPX3可能在子宫内膜中发挥主要的消除H2O2的功能。 利用小鼠体外诱导蜕膜化模型发现,与对照组相比,体外蜕膜化细胞的上清液中H2O2的含量显著下调,而用巯基琥珀酸抑制GPX酶活性或者用siRNA干涉Gpx3,则能抑制H2O2的下调。由Real-time RT-PCR结果看出,与对照组相比,在体外蜕膜化细胞中Gpx3 mRNA显著上调,Gpx1 mRNA显著下调,Gpx4 mRNA没有明显变化,表明在体外诱导的蜕膜化细胞中,GPX3也发挥主要的消除H2O2的功能。在人的体外诱导蜕膜化模型中,也得到了类似的实验结果,表明人子宫内膜中的GPX3也具有相似的功能。 给正常妊娠第5天的小鼠连续3 d腹腔注射GPX酶活性抑制剂,可导致妊娠率明显下降,表明GPX在小鼠的着床和蜕膜化过程中具有重要的作用。给正常妊娠的小鼠注射过量的亚硒酸钠,造成小鼠硒中毒,也可使小鼠的妊娠率明显下降,表明硒元素与妊娠过程也密切相关,而GPX3作为一种硒蛋白可能也在此过程中有一定的作用。根据本研究的结果,GPX3在子宫内膜中发挥消除活性氧的主要功能,并与妊娠过程的顺利进行密切相关。


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