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FMO3基因型和胆碱对鸡蛋三甲胺含量影响的研究

王晶  
【摘要】:本文针对含黄素单氧化酶3(flavin-containing monooxygenase 3, FMO3)基因T239S位点,以海兰褐产蛋鸡为对象,日粮添加氯化胆碱作为前体物质,从遗传和营养两方面系统研究了蛋鸡鱼腥味综合征的影响,旨在探讨FM03基因型和胆碱及其互作对蛋黄三甲胺含量的影响及其作用机制。 试验一:海兰褐蛋鸡鱼腥味综合征易感基因型的测定。采用PCR-RFLP法测定了FM03T329S突变位点在商品代海兰褐壳蛋鸡群体(731只)中的分布规律,分离筛选出鱼腥味综合征易感基因型的产蛋鸡,用于进一步试验。测序检验表明,试验所采用的方法能针对T329S位点,准确地分离筛选FM03基因型。结果表明:所选海兰褐蛋鸡(n=731)中,AA(野生型)、AT(杂合型)和TT(突变型)基因型频率分别为3.4%、76.6%和20.0%,T等位基因频率高于A等位基因。利用Hardy-Weinberg定律检验基因平衡状态,发现该位点在商品代海兰褐蛋鸡群体中极显著地偏离了平衡(P0.001)。 试验二:FM03基因型对蛋黄三甲胺(TMA)沉积的影响。采用单因素设计,选用已知FM03基因型海兰褐壳产蛋鸡132只,按基因型分为4个处理组,每组6个重复。其中AT、TT两种基因型各54只,每重复9只,饲喂试验日粮(添加2 960 mg/kg胆碱);AA基因型24只,分为两个处理,每2只作为一个重复,分别饲喂对照日粮(添加370mg/kg胆碱)和试验日粮。预饲期7天,各组饲喂对照日粮。正试期42天。分别于预饲第3天和第6天,正式试验的第1、2、3、4、5、6、7、10、14、21、28、35和42天,每重复取3枚(AA基因型1-2枚)鸡蛋,分离蛋黄,混匀,比色法测定TMA。结果表明:(1)蛋黄TMA含量随时间呈间歇性变化。AT和TT基因型TMA含量从试验第3天起表现出间歇性上升趋势,分别于第35天和第21天时达到整个试验期最大值(5.02和10.53μg/g);AA基因型蛋黄TMA含量(1-2μg/g)无显著变化;从试验第3天起(35天除外),TT基因型TMA含量显著高于对照组和其他处理组(P0.01);(2)试验1-21天,TT基因型TMA含量快速增加,呈间歇性上升。将鸡蛋TMA沉积量(Y,μg/g)与时间(X,1-21天)进行曲线拟合,得到方程为:Y=0.0036X3-0.1349X2+1.7706X-0.6578(R2=0.9646);(3)2 960 mg/kg胆碱处理下突变基因型蛋鸡鱼腥味鸡蛋通过感官检出时间为3-5天。 试验三:基因型和胆碱对产蛋鸡生产性能、蛋品质的影响。试验按基因型和胆碱水平,采用3×2因子重复设计,每个基因型设2个胆碱添加水平(370和2 960 mg/kg),共6个处理组,每组6个重复,AT、TT两种基因型各108只,每个重复9只,AA基因型24只,每2只作为一个重复。预饲期1周,试验期6周。以重复为单位记录每天产蛋数、蛋重、死亡鸡数,每周记录鸡的耗料量一次。最后计算出1-3周,4-6周和1-6周的产蛋率、日采食量、平均蛋重、料蛋比和日产蛋重。试验第40-42天,每重复收集6枚鸡蛋(AA基因型收集4枚),4℃保存,其中3枚(AA基因型2枚)用于测定蛋品质(保证样品采集到测定间隔相同时间):另外3枚用于制备冻干蛋黄粉,测定蛋黄营养成分。试验结果表明:(1)产蛋率受基因型显著影响(P0.05),AA基因型高于TT和AT基因型;添加2 960 mg/kg胆碱显著降低了蛋鸡日采食量(P0.01)、1-3周料蛋比(P=0.016),基因型与日粮胆碱添加量对产蛋性能无交互作用;(2)基因型对蛋品质无显著影响;日粮添加2 960 mg/kg胆碱极显著降低了蛋黄颜色(P0.001),与370 mg/kg胆碱添加量相比,蛋壳厚度、蛋白高度和哈夫单位有所降低,但无显著性差异;基因型及其与胆碱的交互作用不影响鸡蛋品质。 试验四:基因型和胆碱对产蛋鸡三甲胺代谢的影响。试验设计、试验条件同试验三。试验第7、21和42天,每个重复取3枚蛋(AA基因型2枚),分离蛋黄,混匀,-20℃保存,记录蛋重和蛋黄重,用于测定蛋黄中TMA。于试验第42天,各重复取一只接近平均体重的试鸡,颈静脉放血致死。采集血样,3 000 r/min离心10 min,分离血清,并加入0.01 M HCI固定TMA,-80℃保存。解剖试鸡,无菌棉线结扎盲肠后取出,4℃保存,当天测定TMA。蛋黄TMA和盲肠食糜TMA采用比色法测定,血清TMA采用顶空气相色谱法测定。结果表明:(1)FM03基因型显著影响蛋黄TMA含量,表现为2 960 mg/kg胆碱添加量下,TT基因型TMA含量极显著高于AA和AT基因型(P0.001),但370 mg/kg胆碱处理下,各基因型产蛋鸡蛋黄TMA含量无显著差异;日粮胆碱添加水平对蛋黄TMA有显著作用(P0.05),2 960 mg/kg胆碱处理下,各基因型组蛋黄TMA含量较370 mg/kg胆碱处理下同基因型组均有不同程度升高;FM03基因型和胆碱对蛋黄TMA有显著交互作用(P0.05);(2)基因型对盲肠食糜和血清TMA含量无显著影响,日粮胆碱水平极显著提高了产蛋鸡盲肠食糜和血清TMA含量(P=0.001),二者无交互作用;(3)盲肠食糜TMA含量与血清TMA含量正相关(P=0.061),与蛋黄TMA含量呈显著正相关(P=0.048);蛋黄TMA含量与血清TMA含量无显著相关性(P=0.572),与蛋黄脂肪含量间呈显著正相关(P=0.013)。 试验五:基因型与胆碱对FM03基因表达水平和FM03酶活的影响。试验设计、试验条件同试验三。于试验第42天清晨喂料前,各重复取一只接近平均体重的试鸡,颈静脉放血致死。解剖试鸡,立即取出肝脏、肾脏用冷冻的生理盐水洗去血汁,滤纸擦干称重,剪去结缔组织,液氮冷冻,置-80℃冰柜中保存,提取RNA和肝脏微粒体,分别以底物TMA和甲巯咪唑代谢产物的产率(nmol per mg microsomal protein per min)作为酶活性指标。结果表明:(1)基因型间肝脏FM03基因表达水平无显著性差异(P=0.079);高剂量胆碱极显著降低了肝脏FM03 mRNA表达水平,AA、AT和TT基因型分别下降了19.48%(P0.05)、38.10% (P0.05)和54.29% (P0.01),二者无交互作用。(2)基因型、胆碱水平及二者交互作用对肾脏FM03 mRNA表达量无显著影响。(3)FM03活性受基因型显著影响(P=0.003),AA基因型活性最高,其次AT基因型,TT基因型最低;与370mg/kg胆碱添加水平相比,2960 mg/kg添加量极显著降低了FM03对TMA和甲巯咪唑的代谢活性(P0.01)。 试验六:基因型和胆碱对产蛋鸡脂质代谢和血清激素水平的影响。于试验第42天,每重复随机选取1只鸡,空腹翅静脉采血,离心分离血清,-20℃保存,测定血清和肝脏脂质,血清激素水平,血清一氧化氮水平和丙二醛含量。通过相关分析对血液生理生化指标筛选,探讨基因型、胆碱可能的作用方式。结果表明:(1)血清甘油三酯(P=0.038)、游离脂肪酸水平受基因型显著影响(P=0.001);日粮中添加2 960 mg/kg胆碱改善了机体脂质代谢,表现为降低了血清TG(P=0.038)、NEFA(P=0.001)水平,增加了HDL-C水平(P=0.06),降低了产蛋鸡肝脏中总脂肪(P=0.015)、甘油三酯含量(P=0.006),二者无交互作用。(2)产蛋鸡血糖、血清一氧化氮含量受胆碱水平影响,随胆碱水平增加分别下降27.49%(P0.001)和20.60%(p=0.15),T4水平增加26.05%(P=0.008),T4/T3提高。(3)FM03 mRNA表达水平与血清胰岛素(P=0.004)、T4(P=0.041)、血糖(P=0.017)含量显著相关。 综上所述,FM03基因型对生产性能和蛋品质无明显作用,蛋黄TMA含量受基因型、胆碱添加水平及其交互作用影响。其中,T329S突变导致酶活性的下降是造成基因型间TMA代谢差异的主要原因;添加高剂量胆碱增加了TMA的产生和吸收,同时抑制了肝脏FM03mRNA表达水平和酶活性,加剧了TMA代谢的负担。


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