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小鼠肝窦内皮细胞蛋白质表达谱的构建

侯玉芳  
【摘要】:蛋白质组学运用“一网打尽”的“组学”研究模式,与以往研究单个蛋白质的“钓鱼”模式有所不同,它采用大规模、高通量、高灵敏度的技术手段,通过全局性研究基因组所表达的所有蛋白质在不同时间与空间的表达谱和功能谱,全景式地揭示生命活动的本质。2001年,国际人类蛋白质组组织(Human Proteome Organization, HUPO)成立,提出了人类蛋白质组计划(Human Proteome Project, HPP)。人类蛋白质组计划的首批行动计划包括由美国科学家牵头的人类血浆蛋白质组计划和由中国科学家牵头的人类肝脏蛋白质组计划。而北京蛋白质组研究中心作为国际人类肝脏蛋白质组计划的中心实验室担负着解析肝脏蛋白质表达谱的重任。本文所构建的小鼠肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells, LSEC)蛋白质表达谱隶属于人类肝脏蛋白质组计划的一部分。 肝脏是人体内最大的实质性器官,平均由3 000亿个肝细胞组成,这些肝细胞中含有2000种以上的生物酶,作为人体生物化学反应的媒介,参与人体各类生命活动,正是由于这2 000多种酶所起的作用,肝脏被称为“人体的综合化工厂”,对碳水化合物、氨基酸、脂质及维生素等具有重要的代谢功能;对药物及各种毒素有重要的解毒功能;对消化道来源的抗原具有重要的免疫功能;此外,还具有分泌胆汁、造血储血、合成凝血因子及再生等功能。生物学发展到今天已经进入细胞生物学和分子生物学水平,细胞水平的研究具有简便、快捷、作用单一的优点,肝脏由多种细胞组成,结构和功能非常复杂,体外细胞水平的研究能够加快人们对肝脏各种细胞功能的认识。 样品的制备在蛋白质表达参考图谱的构建中具有重要地位,直接影响质谱结果,而LSEC的纯度及活力直接影响结果的可信度。因此,在LSEC的分离和纯度鉴定上下了比较多的功夫。首先,在肝脏原位灌注消化的基础上,选择特异性很高的免疫磁珠分选的方法来获得LSEC;其次,对得到的LSEC进行了严格的纯度评价,使用了包括流式细胞术,细胞免疫荧光,Ac-LDL胞吞实验在内的3种方法来鉴定LSEC的纯度;再次,为了证实分选得到的细胞就是LSEC,采用扫面电镜和透射电镜来观察LSEC的窗孔结构,窗孔是LSEC区别于其它细胞的标志性结构,是鉴定LSEC的金标准。最终证实分选出来是LSEC,并且纯度达到90%。同时,在分选过程中,我们尽量优化操作,保证LSEC具有很高的活力(94%)和得率(2.6*106细胞/小鼠)。在此基础上,我们建立了从同一组织中同时分离肝脏实质细胞(hepatocyte, HC)、LSEC、Kupffer细胞和星形细胞(hepatic stellate cells, HSC)的标准操作方法(standard operation procedure, SOP),并保证所得每种细胞都具有很高的纯度和活力,为从人肝脏分离四种细胞奠定基础。 采用一维SDS-PAGE,胶内酶切的方式获得蛋白酶切肽段。用LTQ-FT高精度串联质谱仪进行肽段扫描,使用Sequest软件进行检索,数据库使用IPI mouse v3.62,对鉴定数据的评价采用了搜索混合数据库的方法,根据倒置序列占全部肽段的比例来计算假阳性率。在95P2标准下对LSEC鉴定了3 852个蛋白质。 利用获得的蛋白列表构建LSEC蛋白库。对获得的LSEC IPI列表进行一系列的注释,包括鉴定蛋白的Gene ID、Gene名称、Swiss-Prot索取号、Swiss Prot定位信息、GeneOncology(GO)生物学功能及蛋白绝对表达量(absolute protein expression measurements, APEX)非标定量的信息。3 852个鉴定蛋白中有3 824个蛋白有对应的Gene Bank Gene ID和Gene名称,其余28个无对应基因信息;Swiss-Prot数据库收录的有3 059个,这3059个蛋白中有定位信息的有2 405个;有GO生物学功能注释的有3 401个,其中3 116个有明确注释;采用APEX进行非标记定量,共获得1 850个蛋白的相对定量信息。 同样策略已经产出的肝脏细胞数据集还有HC和Kupffer细胞。HC共鉴定到7 842个蛋白,Kupffer细胞鉴定到4 309个蛋白,3组数据进行比较发现3组数据共有的蛋白有1 952个,LSEC、HC和Kupffer细胞各自独有的有736个、4 526个、899个。三种细胞鉴定到的蛋白共对应9 077个基因,在本实验室之前获得的肝脏全组织裂解液和全组织细胞器蛋白质组数据的基础上多鉴定到3 225个基因,相当于多鉴定到37%的基因,这说明我们采用分离细胞富集肝脏中低丰度蛋白的策略是成功的。 把LSEC鉴定蛋白列表与京都基因及基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)进行比对,小鼠KEGG代谢通路有83条,而LSEC鉴定蛋白覆盖到的有73条,100%覆盖的有7条,其中LSEC在碳水化合物代谢、脂质代谢和氨基酸代谢方面功能尤其突出。 对三种细胞鉴定蛋白覆盖的GeneGo通路进行比较,发现三种细胞各自最富集前10条通路中LSEC在蛋白激酶A在细胞骨架重构中的作用、辅酶Q代谢和组胺H1受体在细胞屏障完整性破坏中的作用三条通路中的的功能明显强于HC和Kupffer细胞,提示在LSEC中这3条通路具有活跃的功能。此外,利用GeneGo获得了肝窦内皮细胞与实质细胞及Kupffer细胞相比共有及独有数据新的蛋白质相互作用网络各3条。把自产的LSEC蛋白质组数据和文献报道的LSEC转录组数据进行比较,本实验室共得到LSEC表达基因3 824个,2004年文献报导的LSEC转录组数据鉴定到6 902个基因,其中组学方法获得的基因中有2 370个在转录组中也存在,即蛋白质组的数据有62%在转录组中也有鉴定到。 基于Swiss Prot数据库的FUNCTION注释和GeneOncology中生物学过程和细胞功能的注释信息共获得322个新鉴定到的蛋白质,这些蛋白首次被人们认识到,他们的生物学功能 还有待于进一步验证。综上所述,本研究提出肝脏细胞联合提取策略,并在此基础上建立了从同一小鼠肝脏中同时获得HC、LSEC、Kupffer细胞和HSC的SOP,为中国人肝脏蛋白质组计划中人肝脏四种细胞表达谱的构建奠定了基础。首次成功构建模式动物—小鼠LSEC的蛋白质表达谱,利用GeneOncology,KEGG和GeneGo对得到的蛋白质组学数据进行了分析,为进一步分析LSEC的功能提供了参照。肝脏不同细胞蛋白质表达谱在全组织裂解液和全组织细胞器表达谱的基础上多鉴定37%的数据,证明通过肝脏不同细胞蛋白质表达谱的构建来富集低丰度蛋白、增加肝脏蛋白鉴定量的策略是成功的。


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