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网状内皮组织增生症病毒LAMP检测方法及感染性分子克隆的建立

邓小芸  
【摘要】:网状内皮组织增生症(Reticuloendotheliosis,RE)是禽类一种重要的免疫抑制性和致瘤性疾病。近年来,国内外鸡群中REV流行逐渐严重。REV与马立克氏病病毒(MDV)、鸡贫血病毒(CAV)和J-亚群禽白血病病毒(ALV-J)几种免疫抑制性病毒的混合感染在部分养鸡场中普遍存在,使得鸡群免疫力低下,导致禽流感、新城疫等重要疫苗免疫失败,并容易造成继发感染,使疫病的诊断和防控难度加大。另外,REV基因组易于整合到MDV和FPV基因组中,从而导致商品化疫苗受到污染。使用非SPF禽胚制备的疫苗也有污染REV的潜在危险。近来,RE的危害正逐渐被人们关注,但RE的诊断、流行病学以及基础研究仍不完善。为了更好地认识和防控RE,本文进行了如下方面的研究: 1 REV LAMP可视化快速检测方法的建立 借助新兴的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP),设计了4条针对REV pol基因的6个位点的特异性引物,建立了一套简便、灵敏和特异的检测方法。该方法不与常见的感染鸡群的DNA病毒(MDV、CAV)及ALV-J发生交叉反应,比常规的PCR方法灵敏25倍;另外,该LAMP方法在临床样品方面的检测效率与传统的PCR方法相当;而且操作简单,不需要复杂的仪器,常规水浴锅即可进行,肉眼可直接观察检测结果。 2 REV gp90蛋白的表达及多克隆抗体的制备 利用PCR技术,从病料中扩增REV gp90基因,将其分别克隆至真核表达载体pFastBacHTA和原核表达载体pET-28a(+)中,从而构建了真核表达的供体质粒pF-gp90和原核表达质粒pET28-gp90。pF-gp90转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,使gp90基因整合到Bacmid穿梭载体中,获得重组穿梭载体Bacmidgp90。通过脂质体介导将其转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacgp90。通过Western blot和IFA验证,rBacgp90可正确表达gp90蛋白,蛋白大小约为45kDa,变性和自然状态下均能够被识别,具有良好的生物活性。将pET28-gp90转化至大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,进行gp90蛋白原核表达并通过Western blot检测,确定其以包涵体形式正确表达。纯化gp90蛋白并免疫6-8周龄Balb/c小鼠,制备抗gp90的多克隆抗体。免疫小鼠后获得的抗血清可与感染CEF细胞的REV发生特异性反应,ELISA效价达到1:12800。 3 RE流行病学研究 对我国9个省35个蛋鸡场进行了血清学调查,89%的鸡场REV抗体阳性,阳性率为1%-98%,平均阳性率为15%,说明REV在我国广泛流行,部分地区较为严重。将研磨后无菌处理的病料接种于CEF或DF1,置37℃CO_2培养箱培养,7d后收毒,连续盲传至少3代。做间接免疫荧光、PCR和电镜检测,确定是否分离到病毒。从东北地区的黑龙江、吉林、辽宁等省的一些鸡场分离到10株REV。以HLJR0901为例,测得其TCID_(50)为10~(5.2)/mL。通过绘制复制动力学曲线对其在CEF细胞上的增殖动态规律进行了研究,发现第六天和第七天REV增殖的滴度最高。将所分离的REV的主要保护性抗原基因-gp90基因,克隆至pMD-18T载体,测序并上传GenBank。以前病毒cDNA为模板,将HLJR0901基因组分六段进行了克隆和测序。最后确定:HLJR0901全长8284bp,GenBank登录号为GQ415646。序列分析结果显示:HLJR0901的LTR序列与FA株完全同源;与APC-566的同源性也高达99%。Pol是最稳定基因。LTR核苷酸、gag氨基酸、pol氨基酸、gp90氨基酸、env氨基酸以及全基因组核苷酸的遗传进化树显现了一个共同的特征:①所比较的毒株明显地分为三个分枝,分别代表REV的3个亚型;②东北分离株形成一个独立的群体,与我国早期南方毒株HA9901(亚型I)同源性较低,可能源于不同的祖先;③我国至少存在两种REV亚型(I型和III型),III型REV是目前东北地区的流行毒株。④东北分离株与目前美国和台湾的一些流行毒株亲缘关系较近。 4 REV感染性分子克隆的建立及应用 通过重叠延伸PCR (SOE PCR)和酶切拼接将HLJR0901的全基因组克隆于pBluescript II载体中,并在基因组中通过改变核苷酸(C2250G)消除了其中的MscI酶切位点作为分子标签,构建了REV感染性分子克隆pBlu-mHLJR0901。将纯化的pBlu-mHLJR0901转染鸡胚成纤维细胞(CEF)进行病毒拯救,经间接免疫荧光(IFA)、PCR、测序及电镜鉴定,成功拯救出REV。拯救病毒rHLJR0901在CEF细胞上具有与亲本毒相似的复制特性。基于感染性分子克隆,开展了表达EGFP的重组REV的构建:在HLJR0901全基因组934位点(gag基因启动子上游)和7713位点(env基因终止子下游)插入了EGFP基因,转染CEF细胞后,前者EGFP能够瞬时高效表达,后者不能表达。但最终均没有拯救出重组病毒,其具体机制有待进一步探讨。本研究还发现,REV LTR的启动子功能具有广谱性,不仅在鸡源细胞上能够被识别,而且在哺乳细胞上也能被识别。这些结果为REV的基础研究提供了参考。 5 REV动物感染实验 将拯救的REV毒株rHLJR0901通过腹腔接种途径感染1日龄SPF雏鸡,进行REV的致病性研究。结果显示:2周龄时REV能够明显影响鸡的生长性能;REV对肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊等免疫相关器官均有一定程度的影响;感染后3w时血清开始阳转,但血清抗体阳性率一直是75%;整个实验周期内均可检测到病毒血症。动物感染实验为REV病毒感染模型的建立提供了必要的数据,并提示病毒血症可以作为REV病毒感染模型的稳定指标之一。


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