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新城疫病毒单克隆抗体制备及部分NP蛋白抗原表位鉴定分析

刘培欣  
【摘要】:新城疫(ND)是危害世界养禽业的重要疾病之一,目前对其病原新城疫病毒(NDV)进行了大量的研究,可是对于NDV编码蛋白的结构与功能以及致病机理还未完全阐明。应用单克隆抗体仍是对NDV编码蛋白进行结构与功能分析、表位鉴定以及强弱毒鉴别诊断的基本手段之一。 本研究分别构建了含有NDV基因Ⅶ型QY97株F基因全长及部分基因片段FA(1-357bp)、FB(336-1047bp)和FC(948-1662bp)的原核表达载体。经IPTG诱导后,在大肠杆菌中成功地表达了含F蛋白部分片段(FA、FB和FC)分子量分别为30.6ku、43.5ku和43.7ku的3个融合蛋白,其中FA片段对应F2蛋白,FB和FC分别对应部分重叠的F1蛋白的两个片段。Western-blot结果表明表达的融合蛋白FB和FC具有良好的反应原性。以原核表达的融合蛋白FB和FC免疫小鼠,获得了针对NDV F蛋白FB和FC片段的单克隆抗体各1株,分别命名为FB-B9和FC-B5。 以NDV QY97株全病毒免疫6周龄BALB/c雌性小鼠,采用细胞融合技术制备单克隆抗体。经间接ELISA和间接免疫荧光试验筛选,共获得了15株NDV杂交瘤细胞。其中5A12属于IgG2a亚型,18C6属于IgG2b亚型,31B4和33F12属于IgM亚型,其余均属于IgG1亚型。这15株单克隆抗体均无中和活性和血凝抑制活性。采用夹心ELISA对不同单抗与10株属于不同基因型的NDV进行交叉反应,结果表现出不同的反应性。 用纯化的NDV QY97株作为抗原,与所获得的单抗进行Western-blot反应,结果表明18C6、24F9和25C12与病毒55ku左右的片段反应,因此这3株单克隆抗体针对的是NDV结构蛋白的线性表位,可能是针对NDV NP蛋白或者F蛋白的单抗,其它几株单克隆抗体与病毒蛋白没有明显的反应,可能是针对NDV结构蛋白构象表位的单抗。 选取10株分属于基因Ⅰ型、基因Ⅱ型、基因Ⅵ型、基因Ⅶ型和基因Ⅸ型的毒株作为代表株,进行了识别线性表位的3株单抗18C6、24F9和25C12与不同NDV毒株之间的间接ELISA和Western-blot交叉反应。试验结果与夹心ELISA结果相符,单抗18C6只与CK/CH/HLJ/1/06(ZY)、CK/CH/HN/1/07(LHN)、Mallard/CH/HLJ01/06(JL01)和QY97株有反应性,24F9与除基因Ⅵ型PG/CH/JS/1/06(Y4)毒株以外的所有毒株有反应性,而25C12与10株NDV均有反应性。 进一步利用原核表达系统表达了系列截短的NP蛋白多肽片段,采用Western-blot对18C6和24F9所识别的线性表位进行定位。结果发现这两株单抗都是针对NP蛋白的C-末端,18C6识别的抗原表位位于NP蛋白的第473-481位氨基酸之间,其多肽序列为(473)~PPPTPGASQ~(481);24F9识别的抗原表位位于NP蛋白的第470-478位氨基酸之间,其多肽序列为(470)~HPEPPPTPG~(478)。两个抗原表位相互重叠,具有共同的核心序列(473)~PPPTPG~(478)。 本试验扩增了4个分离株的NP基因,进行了23株NDV NP基因的序列分析,结果表明,NP基因全长序列比较保守,但是在C-末端的401-489位氨基酸差异较大,在弱毒株之间比较序列同源率较高,均在83.5%以上;强毒株之间的序列同源率与基因型相关,同一基因型内同源率均高于84.4%,但是强弱毒之间的序列同源率有的仅为67%。NP蛋白401-489位氨基酸之间的差异说明NP基因在病毒进化过程中也呈现一定的变异规律。单抗24F9所识别的470-478位氨基酸序列在各基因型毒株中也有所不同,在NDV基因Ⅶ型毒株的序列中相对比较保守,为(470)~HPEPPPTPG~(478);而在基因Ⅵ型毒株中的序列为(470)~H(P/L)EP(L/P)(S/P)HE~(478),第477位的组氨酸未在其它基因型毒株中出现;在弱毒株中的序列为(470)~Q(S/L)GPPPTPG~(478),与强毒株比较至少有三个氨基酸的差异。 本研究采用全病毒免疫小鼠制备了15株NDV单克隆抗体,采用原核表达的F蛋白FB和FC多肽免疫获得了针对F蛋白的单抗2株。所获单抗与NDV不同基因型毒株呈现不同的反应性。进行了NP基因的序列分析,发现NP蛋白的C-末端氨基酸序列在不同基因型强弱毒之间有所不同,利用获得的单抗在NP蛋白C-末端上鉴定了两个具有共同核心基序的重叠表位。本研究为NDV编码蛋白进行结构与功能分析、表位鉴定以及强弱毒鉴别诊断等方面的深入研究奠定基础。


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