日本血吸虫Wnt信号通路受配体的鉴定及初步分析

【摘要】：血吸虫病是由血吸虫感染引起的,是一种严重危害人类健康的人畜共患寄生虫病。长期以来对于血吸虫病的防治主要采取药物治疗(毗喹酮)的方法,但是长期反复的用药容易引起血吸虫的耐药性,因此研制新的抗血吸虫病的治疗药物是当前的首要任务。若使血吸虫病新药的研究取得突破性的进展,研究者们需充分了解血吸虫生长发育的过程及其相关的调控机制。由Wnt蛋白、Frizzled家族受体蛋白及其相关的上下游信号分子构成的Wnnt信号通路,是细胞发育和生长调节的关键途径,对动物的生长发育起着重要的调节作用。本课题组已经成功的获得了日本血吸虫信号转导蛋白SjWnt4和SjWnt2,以及3个Wnt受体蛋白Frizzled的基因以及其它一些相关分子,并对其进行了表达及生物学功能的研究,初步确定在日本血吸虫体内也存在Wnt信号通路。但是对于Wnt信号通路在血吸虫生长发育中的功能及分子机制需有待进一步阐明。 本研究的方法如下：将日本血吸虫与曼氏血吸虫已知的Wnt和Frizzled序列进行同源性比对,选择保守性好的氨基酸序列进行设计引物,利用touch-up PCR方法扩增日本血吸虫Wnt信号通路受配体编码基因的EST,再利用RACE技术、电子拼接等方法获得全长序列；利用jenomeWalkerTM Universal Kit分析日本血吸虫Wnt2的基因结构。利用基因克隆技术构建SjWnt2-(60aa-368aa)基因的原核表达载体,并进行SjWnt2-(60aa-368aa)蛋白的表达、纯化及免疫原性分析,制备SjWnt2-(60aa-368aa)的小鼠多抗血清,ELISA技术测定抗体效价,Western blot方法鉴定血清的特异性；利用免疫组化(IHC)方法检测SjWnt2-(60aa-368aa)和SjFz5蛋白在不同期别虫体的组织定位。 主要研究结果：(1)获得日本血吸虫Wnt信号通路新基因4个,其中3个(Sjwnt5a、Sjwnt1、 Sjwnt11)为Wnt家族相关基因,1个(Frizzled8)为Frizzled受体基因；对已获得的Wnt2基因结构分析发现其含有4个内含子,其中内含子1、3、4由于序列比较长未完全测通,内含子2大小为653bp。(2)成功构建SjWnt2-(60aa-368aa)基因的原核表达质粒,应用大肠杆菌系统进行了表达,Western blotting显示表产物能被日本血吸虫虫卵抗原免疫兔血清所识别,具有良好的抗原性。将表达、纯化后的抗原免疫小鼠,制备SjWnt2-(60aa-368aa)卜鼠多抗血清,Western blotting显示SjWnt2-(60aa-368aa)蛋白的抗血清能与虫体天然蛋白中的单一蛋白条带发生反应。免疫组化(IHC)结果显示SjWnt2-(60aa-368aa)蛋白主要分布在血吸虫童虫和成虫的吸盘及体壁肌层细胞膜上,而且在雌雄虫的生殖器也有明显定位。(3)免疫组化(IHC)结果显示SjFz5蛋白呈现广泛分布,在虫体的口吸盘、腹吸盘、体壁肌细胞层等都有阳性着色。另外,在雌虫卵细胞、卵黄细胞以及雄虫的精细胞上都可见明显的阳性反应。 总之,本论文成功获得了与Wnt信号通路相关的可能配体SjwntSa、Sjwntl、Sjwntll及可能的受体Frizzled8基因,为进一步探索日本血吸虫Wnt信号通路受配体相互作用提供了实验材料。并对已有的SjWnt2和SjFz5进行了免疫组化定位分析,结果我们发现,SjWnt2和SjFz5蛋白均在血吸虫雌雄虫的生殖器上有明显的定位。初步推测SjWnt2和SjFz5可能参与调节两性生殖细胞的发育,本研究为深入的研究Wnt信号通路在日本血吸虫生长发育中的作用,寻找发育调控中的关键信号分子,积极发现新的药靶奠定了基础。