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农杆菌介导EPSPS抗草甘膦基因转化马铃薯品种

王石  
【摘要】:本研究所用外植体为马铃薯品种费乌瑞它的脱毒微型薯,利用农杆菌介导法将EPSPS抗草甘膦基因导入马铃薯,经PCR.PCR-Southern和Southern检测,证明EPSPS基因已转入马铃薯基因组中。经RT-PCR检测,证明EPSPS基因在马铃薯基因组中能够正常转录。试验建立了高效的马铃薯再生体系和遗传转化体系,同时对遗传转化影响因素中的:激素种类与浓度、脱菌抗生素的种类与浓度、共培养时间、筛选方式等进行了优化研究。通过了对抗性植株的抗草甘膦测定,初步验证了转基因马铃薯对草甘膦表现出抗性。主要研究结果如下: 1)确定了适宜于马铃薯品种费乌瑞它的薯块再生培养基为MS+1mg/L IAA+4mg/LZT。 2)确定了农杆菌浓度为OD600=0.5,侵染时间为6min时,薯片出芽率为72.43%,污染率为8.7%。 3)共培养时间对愈伤组织诱导率影响很大,薯片最佳共培养时间为3d。 4)对不同的脱菌抗生素的浓度进行了比较试验,羧苄青霉素对含EPS_PS基因的农杆菌有效抑菌浓度是450mg/L,国产哈药头孢噻肟钠的有效抑菌浓度是450mg/L,进口Invirogen头孢噻肟钠的有效抑菌浓度是150mg/L。 5)试验采用的抗性选择剂是草丁膦(PPT),筛选方式为延迟5d筛选,结果表明薯片芽诱导阶段PPT浓度为6mg/L,生根阶段的PPT浓度为4mg/L。 6)试验获得抗性植株38株,经PCR检测有17株呈阳性,进一步的PCR-Southern杂交出现10株阳性信号,初步表明EPSPS基因已经整合到马铃薯基因组中。随机选取7株PCR-Southern杂交阳性植株进行RT-PCR,有6株扩增出阳性条带,说明外源基因在转基因植株中能够转录,最后通过Southern杂交出现5株阳性信号,进一步证明了EPSPS基因已经整合到马铃薯基因组中。 7)对T1代5株转基因植株进行了PCR检测,获得阳性植株4株,并对其进行草甘膦抗性鉴定结果表明转EPSPS基因植株能够耐受草甘膦浓度可达0.4g/L,是草甘膦田间施用量的5-6倍,由此可以证明EPSPS基因在后代中表达。


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