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五个新的鸭β-防御素的分离、鉴定及其抗病毒机制的初探

张可心  
【摘要】:防御素是广泛存在于动植物体内的一类富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽,具有抑制细菌、真菌和囊膜病毒的作用,其独特的抗菌机制避免了传统抗生素易使细菌产生耐药性等问题,有望代替抗生素成为新型的饲料添加剂。禽抗菌肽属于β-防御素类,具有高效、广谱的抗菌活性,在禽类先天性免疫系统中发挥着重要作用。 本研究采用RT-PCR方法,分别从鸭肺脏和骨髓组织中扩增到5个新的β-防御素基因,将测序结果与已发现的禽β-防御素(AvBD)和部分哺乳类动物β-防御素的氨基酸序列构建进化树并进行同源性分析。结果显示,这5个基因分别是鸭AvBD1、鸭AvBD3、鸭AvBD5,鸭AvBD6和鸭AvBD16。其中,鸭AvBD1cDNA大小为198bp,编码65个氨基酸,与鸵鸟AvBD1氨基酸同源性最高为78%;鸭AvBD3cDNA大小为182bp,编码60个氨基酸残基,与鸡AvBD3氨基酸同源性高达100%;鸭AvBD5cDNA大小为201bp,编码66个氨基酸残基,与鸡AvBD5氨基酸同源性达97%;鸭AvBD6cDNA大小为204bp,编码67个氨基酸残基,与鸡AvBD6氨基酸同源性高达100%;鸭AvBD16cDNA大小为155bp,编码50个氨基酸,与鸡AvBD3同源性最高,为62%。 将这5个鸭AvBD基因分别亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1,转化大肠杆菌BL21,进行IPTG诱导表达。将表达的蛋白进行纯化,同时根据其各自的氨其酸序列分别合成相应的5条多肽。以4种革兰氏阳性菌和8种革兰氏阴性菌为检测菌,采用菌落计数法测定重组和合成的鸭AvBD1、3、5、6、16和GST蛋白的抗菌活性,以及盐离子浓度对其抗菌活性的影响。并对这些蛋白的溶血活性进行测定。结果表明,与GST标签蛋白相比,重组和合成鸭AvBD1、3、5、6和16蛋白对12种细菌均有显著的抑制作用(P0.05或P0.01)。在高盐浓度下,这些蛋白对四联球菌和多杀性巴氏杆菌的抗菌活性显著降低(P0.05或P0.01)。此外,这些蛋白溶血活性极低,与阴性对照相比,无显著差异(P0.05)。本试验还测定了这5个重组蛋白的体外抗鸭肝炎病毒作用,结果表明,与阳性对照(病毒组)相比,这些重组蛋白显著延长了鸭胚的存活时间(P0.05或P0.01),相反地,GST无显著作用(P0.05),表明这些重组蛋白具有抗鸭肝炎病毒的作用。 为探讨这些鸭AvBDs基因在体内组织中的表达水平是否受鸭肝炎病毒诱导,及其抗病毒作用的信号转导机制。本研究以鸭肝炎病毒感染鸭,采用荧光定量PCR方法,分别检测了攻毒后24h、32h、48h、72h、96h鸭体内法氏囊、脾脏、胸腺、盲肠扁桃体、骨髓、肝脏、肾脏和肺脏组织中这5个鸭AvBDs基因的表达量,以及几个细胞因子:鸭白介素-2(IL-2)、白介素-18(1L-18)和γ干扰素(IFN-γ),以及Toll样受体7(TLR7)基因在除肾脏和肺脏外的上述组织中的表达量。结果显示,经鸭肝炎病毒诱导后,除鸭AvBD1、3年和IFN-γ在肝脏中没有被诱导表达外,其余基因在肝脏组织中均被诱导表达或表达量显著上调(P0.05或P0.01)。此外,在攻毒后的各个时间点,也检测到这些基因在其他组织中发生诱导表达或表达水平显著上调(P0.05或P0.01)。同时,本试验结果还显示,这些防御素和细胞因子在组织中的表达量与TLR7的表达量呈正相关。上述结果揭示,这些鸭AvBDs与细胞因子在体内的抗病毒作用可能受TLR7介导的信号转导通路调控。


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