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酪蛋白ACE抑制肽的类蛋白反应修饰与溶剂分级研究

孙辉  
【摘要】:以往研究表明,酪蛋白是生物活性肽的重要来源。本研究以酪蛋白水解物为底物,分别在有无脯氨酸存在下进行类蛋白反应,改变酪蛋白水解物的ACE抑制活性;同时进行溶剂分级处理,并对高活性肽组分进行体外酶抗性分析和电泳分析。 利用碱性蛋白酶水解酪蛋白制备酪蛋白水解物而后对其进行碱性蛋白酶催化类蛋白反应修饰。水解时间为6h的水解物的ACE抑制活性最高,相应的水解度为10.9%、IC50值为52.6μg/mL。利用中心组合设计和响应面分析法优化修饰反应条件,固定反应时间6h,以反应体系中游离氨基减少量为响应值,得到的最适反应条件为:酶添加量3.1kU/g蛋白质、反应温度25℃、酪蛋白水解物的浓度50%(w/v),此条件下反应体系中游离氨基减少量达到112.1μmol/g蛋白质。 酪蛋白水解物在有(添加量0.6mol/mol游离氨基含量)无脯氨酸条件下分别进行不同程度的类蛋白反应修饰,并测定不同修饰程度修饰产物的ACE抑制活性和个别产物的IC50值。酪蛋白水解物的ACE抑制活性均随修饰程度的增加而提高,并且都高于酪蛋白水解物。无脯氨酸添加时修饰产物的游离氨基含量为1668.8μmol/g蛋白质时,相应修饰产物的IC50值可降至14.9μg/mL;而在添加脯氨酸条件下修饰产物游离氨基含量为1593.3μmol/g蛋白质时,相应修饰产物的IC50值可降至13.0μg/mL。 对上述酪蛋白水解物和修饰产物进行体积比为3:7、5:5、7:3的乙醇-水和甲醇-水溶剂分级,同时对修饰产物进行水分级做对照,分级得到上清液和沉淀两部分分级产物,测定它们的回收率、游离氨基含量和ACE抑制率及个别产物的IC50值。酪蛋白水解物7:3(v/v)乙醇-水和甲醇-水分级得到的上清液部分(沉淀部分)ACE抑制活性明显高于(低于)原水解物,而类蛋白产物进行乙醇-水和甲醇-水溶剂分级处理,产生相似的结果。无脯氨酸存在下修饰产物7:3(v/v)乙醇-水分级的上清液部分游离氨基含量为1684.4μmol/g蛋白质,IC50值可降至11.8μg/mL,水分级的沉淀部分游离氨基含量为1577.8μmol/g蛋白质,IC50值可降至12.6μg/mL;有脯氨酸存在下修饰产物的7:3(v/v)乙醇-水分级上清液的游离氨基含量为1582.7μmol/g蛋白质,IC50值可降至10.0μg/mL,水分级的沉淀部分游离氨基含量为1544.7μmol/g蛋白质,IC50值可降至11.3μg/mL。所以,低极性溶剂可以用于分离高活性肽组分。 碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶对酪蛋白修饰产物及其分级产物进一步酶水解10和30min后活性均有下降。除碱性蛋白酶外,不同产物对胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶的抗拒能力相对较强,在反应体系浓度为0.025mg/mL的条件下ACE抑制活性在31~50%,均高于酪蛋白水解物(27.8%)。酶抗性分析结果表明四种酶均能破坏其原有活性,碱性蛋白酶对疏水性氨基酸有高度的专一性,对肽中的疏水肽段优先作用导致活性降低明显。进一步水解后的不同产物ACE抑制活性大多高于酪蛋白水解物,表明类蛋白反应提高了酪蛋白水解物的ACE抑制活性与体外酶抗性。Tricine-SDS-PAGE电泳分析结果显示出修饰产物、分级产物和酪蛋白水解物电泳图谱的明显不同,表明有新的肽段生成。这些新生成的肽段可能是修饰产物和分级产物ACE抑制活性提高的主要原因。


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