蛋白质氧化对鲤鱼蛋白结构和功能性的影响及其控制技术

【摘要】：本文以鲤鱼肌肉为研究对象，系统研究了羟基自由基氧化体系（HRGS）（由0.1mM FeCl3，0.1mM抗坏血酸和不同浓度的H2O2组成）对肌原纤维蛋白理化性质、蛋白结构以及蛋白质功能特性影响；并研究了不同漂洗条件（未漂洗，传统漂洗，添加抗坏血酸钠漂洗，添加没食子酸丙酯（PG）漂洗），以及添加抗冻剂（4%蔗糖+4%山梨醇）和乳清蛋白（WPI）水解物（对照，添加商业抗冻剂，添加商业抗冻剂+PG，添加抗冻剂+WPI水解物）引起的蛋白质氧化及其对蛋白结构和蛋白质功能特性的影响，阐明了由于氧化引起的鱼肉质量劣变和蛋白质变性的机理。肌原纤维蛋白质结构和蛋白氧化方面主要测定了羰基和二聚酪氨酸的含量、总巯基含量、ATPase酶活性、表面疏水性、蛋白质热稳定性和蛋白聚集和降解；肌原纤维蛋白质功能特性的变化主要测定了蛋白质的浊度、溶解性、乳化性、流变学特性、凝胶特性（白度值、保水性、质构、凝胶微观结构）。主要研究结果为： 1.羟基自由基攻击会引起肌原纤维蛋白质结构发生明显改变，如肌原纤维蛋白经过0.1、1、5、10和20mM H2O2氧化5h后，与对照组相比羰基含量分别增加了28.6%、47.6%、61.9%、71.4%和83.3%（P0.05）；总巯基含量分别减少了11.1%、19.2%、25.6%、37.9%、49.4%（P0.05）。除此之外，蛋白质的二聚酪氨酸含量和表面疏水性随氧化强度的增加也呈增加趋势；通过DSC测定蛋白的热稳定性，得出氧化过程中肌肉蛋白的热转变温度和焓值均降低，表明蛋白质发生氧化后，热稳定性变差；蛋白的SDS-PAGE电泳图谱结果显示，氧化使蛋白结构发生改变，表现在电泳图谱的顶端浓缩胶处出现了大分子的聚合物。以上结果说明，自由基攻击引起的蛋白质氧化会引起蛋白质的结构的破坏。 2.自由基氧化引起的蛋白质结构的改变，进一步影响了肌肉蛋白质的功能特性。肌原纤维蛋白在氧化体系经过浓度0.1、1、5、10和20mM H2O2氧化5h后，与对照组相比蛋白质溶解性分别降低了12.7%、19.5%、28.9%、34.3%和44.7%（P0.05）；乳化活性降低了1.0%、4.8%、14.0%、18.5%和26.1%（P0.05）；乳化稳定性降低了1.3%、4.6%、12.4%、26.7%和31.1%（P0.05）。经自由基氧化后，蛋白质的浊度水平也随氧化剂浓度和氧化时间的增加而增加，说明蛋白质发生了聚合作用。 3.自由基氧化会引起肌原纤维蛋白凝胶特性的变化。蛋白氧化降低了蛋白质的凝胶化作用，导致凝胶硬度、弹性等质构参数和流变学参数G′（贮存模量）、G′′（损失模量）均有明显降低，同时凝胶持水性、白度值也明显降低，通过凝胶微观结构电镜也进一步验证了此结果。肌原纤维蛋白经过0.1、1、5、10和20mM H2O2氧化5h后，凝胶弹性降低了10.3%、13.2%、14.3%、22.2%和23.5%（P0.05）；凝胶硬度降低了19.0%、24.6%、46.7%、50.7%和60.9%（P0.05）。凝胶保水性和凝胶白度的变化趋势与此相同。新鲜鲤鱼肌原纤维蛋白形成致密、均匀的三维立体网络结构，氧化后肌肉凝胶结构疏松、网络孔径增大、粗糙、断裂、甚至出现小团块的现象，而且氧化剂浓度越高，氧化时间越长，肌原纤维蛋白凝胶性能破坏越严重。经过不同氧化剂浓度和不同氧化时间处理后的样品的G′、G′′值也呈下降趋势，这反应了凝胶弹性的降低，对样品的G′′/G′（损失因子）分析同样得出，当鲤鱼肌原纤维蛋白受氧化攻击后，形成的凝胶弹性有所损失。以上结果说明，蛋白质氧化引起的蛋白结构改变，破坏了凝胶形成过程中三维网状结构的形成，减弱分子间作用力和氢键的作用。从而影响了蛋白质的凝胶特性。 4.蛋白质经自由基攻击发生氧化后，对蛋白结构指标和功能指标进行相关性分析得出，二者之间相关性极高，说明一定程度的氧化引起的蛋白结构改变导致了很多功能性的降低。所以，在实际生产中应合理控制蛋白氧化的发生。 5.冷冻贮藏过程中鱼糜蛋白中羰基和二聚酪氨酸的含量明显增加，说明鲤鱼肌原纤维蛋白在冻藏过程中发生了蛋白质氧化，并进一步影响蛋白质的结构和功能。不同漂洗方法对冻藏鲤鱼鱼糜肌原纤维蛋白的结构有一定的影响。冻藏90d时，对照组、传统漂洗组、添加抗坏血酸钠漂洗组、添加PG漂洗组的羰基含量分别增加了39.2%、47.5%、62.8%和27.1%，说明添加PG可以在一定程度上抑制蛋白质氧化的发生，但是添加抗坏血酸钠可以促进氧化的发生。对其它结构指标（巯基含量、蛋白质ATPase酶活性、表面疏水性、蛋白质的热稳定性和SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳）和功能指标（蛋白质的浊度、溶解性、乳化性、流变学特性、凝胶特性）的分析也证明了这一结论。 6.添加抗冻剂和不同抗氧化剂对冻藏的鲤鱼鱼糜肌原纤维蛋白具有一定的保护作用。结果表明冻藏引起鱼糜蛋白质羰基和二聚酪氨酸的含量明显增加，而总巯基的含量下降。添加抗冻剂（4%蔗糖+4%山梨醇）和WPI水解物对蛋白质氧化有显著的抑制作用。如冻藏90d时，对照组、添加抗冻剂组、添加抗冻剂+PG组、添加抗冻剂+WPI水解物组的羰基含量分别增加了55.7%、46.1%、25.6%和22.4%，巯基含量分别下降了34.5%、28.6%、19.2%和20.9%。结果说明在冻藏过程中添加PG和WPI水解物可以有效地抑制蛋白质氧化的发生。对其它结构指标（ATPase酶活性、表面疏水性、蛋白质的热稳定性和SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳）和功能指标（蛋白质的浊度、溶解性、乳化性、流变学特性、凝胶特性）的测定也证明了这一结论。由于WPI水解物为天然抗氧化剂，所以今后鱼糜冻藏过程中可以安全的使用，以此来提高鱼糜质量。