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β-甘露聚糖酶基因和牛凝乳酶基因黑曲霉工程菌的构建

张莹莹  
【摘要】:β-甘露聚糖酶(endo-1,4-β-D-mannanase;mannohydrolase;EC3.2.1.78)是一类半纤维素酶类,能够水解甘露聚糖中的β-1,4-D-甘露糖苷键,广泛存在与动植物和微生物中。β-甘露聚糖酶在食品、饲料、造纸、洗涤、石油开采及生物研究技术等方面得到广泛应用。美国ChemGen公司开发的β-甘露聚糖酶产品“和美酵素”,其售价高达60万元/t。因此,要打破国外公司对国内市场的价格垄断,实现β-甘露聚糖酶的大规模应用,通过基因工程手段表达β-甘露聚糖酶是解决这一问题的有效途径。 凝乳酶可以引起蛋白质凝聚,导致牛奶凝结,是奶酪工业化生产的关键酶。凝乳酶主要是从小牛皱胃中获取的,由于乳酪需求不断加大,造成全球小牛短缺使得凝乳酶的来源并不稳定,为了解决这一矛盾,国外相继开展了牛凝乳酶基因工程的研究并获得了良好的经济效益。 本研究以糖化酶生产菌株黑曲霉CICC2462为受体菌,针对高表达的糖化酶基因(glaA)位点,构建黑曲霉表达载体pSZH-MAN和融合表达载体pSZH-GCYM,采用农杆菌介导法对黑曲霉进行遗传转化,以期实现目的基因的高效分泌表达,从而为构建安全高效的黑曲霉工程菌奠定了基础。此研究为简化β-甘露聚糖酶、牛凝乳酶发酵生产工艺,提高β-甘露聚糖酶、牛凝乳酶产量提供了新的途径。 主要研究结果如下: 1.β-甘露聚糖酶基因在黑曲霉中的表达 采用PCR方法,以黑曲霉CICC2462的基因组DNA为模板,克隆得到1275bp的β-甘露聚糖酶基因(MAN),将MAN基因与glaA基因的5'、3'同源臂进行重叠延伸PCR,构建MAN基因的重组表达框GMG。将此表达框插入黑曲霉表达载体pSZH-CYM中,构建黑曲霉重组表达载体pSZH-MAN。将载体pSZH-MAN通过农杆菌介导法转化黑曲霉CICC2462,经潮霉素筛选和PCR鉴定获得4株重组菌株。并从其中筛选出在glaA基因位点发生基因置换的同源重组菌株1株。而后通过连续传代、筛选和PCR检测,获得了纯合的同源重组菌株。对重组菌株进行发酵培养、酶活性检测和SDS-PAGE分析,表明在糖化酶摇瓶发酵条件下,重组菌株培养液上清的β-甘露聚糖酶活性最高可达12467.2U/mL,是出发菌株的72倍,是生产水平的12-15倍。此研究为简化β-甘露聚糖酶发酵生产工艺、提高产量提供了新的途径。 2.牛凝乳酶基因在黑曲霉中的表达 通过农杆菌介导法将本实验室已构建好的黑曲霉表达载体pSZH-CYM转化黑曲霉CICC2462。经潮霉素筛选和PCR鉴定获得3株重组菌株。并从其中筛选出在glaA基因位点发生基因置换的同源重组菌株1株。而后通过连续传代、筛选和PCR检测,获得了纯合的同源重组菌株。对重组菌株进行发酵培养、酶活性检测结果表明CYM基因在黑曲霉CICC2462中得到了表达,酶活最高可达960u/mL。 为了进一步提高牛凝乳酶基因(CYM)在黑曲霉CICC2462中的表达量,将CYM基因与黑曲霉CICC2462高表达glaA基因进行融合表达。构建黑曲霉重组融合表达载体pSZH-GCYM。将载体pSZH-GCYM通过农杆菌介导法转化黑曲霉CICC2462。经潮霉素筛选和PCR鉴定获得4株重组菌株。并从其中筛选出在glaA基因位点发生基因置换的同源重组菌株2株。但尚未检测到酶活。


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