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奶牛乳腺上皮细胞JAK2-STAT5和mTOR信号通路协同调控乳蛋白合成

史琳琳  
【摘要】:本研究以乳蛋白合成的信号通路为切入点,选择乳蛋白基因表达必不可少的JAK-STAT5信号通路中的STAT5信号分子,与乳蛋白翻译合成密切相关的PI3K-AKT-mTOR信号通路中的AKT1和mTOR信号分子进行调控,并分析两条关键通路间的相互作用,揭示调控奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成过程中的信号协作机制。 本研究选取中国荷斯坦奶牛为研究对象,利用分离自高乳品质泌乳奶牛乳腺的乳腺上皮细胞(DCMEC)建立实验用细胞系,分析鉴定细胞生物学特性。以无血清的分化培养基DIP(包含氢化可的松、胰岛素、催乳素)激活奶牛乳腺上皮细胞相关泌乳信号途径,提供乳蛋白合成必需的基本条件,额外添加胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和生长激素(GH)作为外源泌乳刺激物激活或加强泌乳信号途径,应用荧光定量PCR(qRT-PCR)及蛋白质印迹(Western blotting),分析IGF-1、GH对AKT1、STAT5和mTOR表达及其磷酸化状态的影响。通过瞬时转染RNAi方法,分别对AKT1和STAT5基因进行基因沉寂,检测AKT1、STAT5和mTOR在mRNA和蛋白质表达以及活性磷酸化状态变化,并进一步综述对奶牛乳腺上皮细胞β-casein合成能力的影响。 通过以上实验得出,添加IGF-1、GH后,促进了奶牛乳腺上皮细胞的增殖能力和细胞活力。qRT-PCR和Western blotting实验结果显示,随时间变化AKT1和mTOR及其磷酸化形式在mRNA和蛋白质水平的表达呈递增趋势,当培养至24h时,其表达量的变化显著高于处理前(P0.05),IGF-1、GH组与对照组相比,其表达量也显著上升(P0.05),但是STAT5、p-STAT5的表达在此段时间变化相对复杂,在24h内表达量呈上升趋势,并且IGF-1、GH对它们的表达具有促进作用。通过基因沉寂实验,干扰AKT1或STAT5基因,AKT1、STAT5和mTOR的mRNA显著减少(P0.05),并且其蛋白水平也发生同步变化,p-STAT5、p-AKT1和p-mTOR的蛋白表达量也显著减少(P0.05)。基因沉寂的基础上,添加IGF-1、GH后与对照组相比,β-casein mRNA表达量明显上升(P0.05);但相同处理组内干扰组与对照组相比,AKT1、STAT5和mTOR及其磷酸化形式也显著下降(P0.05),β-casein在mRNA水平的表达也明显下降(P0.05),细胞增殖能力和活力显著减少(P0.05)。 综上所述,在奶牛乳腺上皮细胞中,AKT/mTOR和JAK2/STAT5信号通路均影响β-casein的合成。当负调控基因AKT1或STAT5时,无论在mRNA或是蛋白质水平,一方的表达都会随着另一方的改变而改变,并影响其下游mTOR信号通路,抑制β-casein mRNA表达和乳腺上皮细胞的增殖能力、细胞活力。而IGF-1或GH的应用可以激活AKT/mTOR和JAK2/STAT5信号通路,增强β-casein mRNA表达和细胞的增殖能力和细胞活力。


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