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碱胁迫下野生大豆叶片蛋白质组的双向电泳分析

张宁  
【摘要】:土壤盐碱化是一个世界性的资源问题和生态问题,据不完全统计,我国约有9913万公顷盐碱地,盐碱逆境严重制约我国农业生产。开发利用盐碱地是保持我国农业持续高效发展、保证我国粮食安全亟待解决的重大问题。野生大豆(Glycine soja)是栽培大豆的近缘野生型,具有优异的耐盐碱、抗寒和抗病害能力,是我国宝贵的野生资源财富。野生大豆不仅具有极高的耐碱性(可在p H10的土壤中生存),还可降低盐碱土中水溶性盐离子的含量。因此,研究野生大豆的耐碱机理,对培育耐碱作物、控制和利用盐碱土有重要作用。蛋白质是植物生命活动的直接执行者。因此,通过双向电泳技术构建野生大豆在逆境胁迫下的蛋白表达谱,筛选差异表达蛋白,分析碱胁迫下野生大豆差异表达蛋白的表达模式对研究其耐逆机制具有重要的作用。本研究以课题组前期筛选的耐碱野生大豆G07256为试材,为探讨其耐碱特性,以50mmol·L-1 Na HCO3对其进行胁迫处理。检测了7个与碱胁迫相关的生理指标;建立了野生大豆叶片蛋白质组双向电泳体系;构建了碱胁迫下野生大豆叶片的差异蛋白质表达谱,初步分析了差异表达蛋白的等电点、分子量分布和表达模式。本研究为获得碱胁迫应答相关的差异蛋白奠定了良好的基础。主要研究结果如下:1.碱胁迫下野生大豆的生理指标分析为了解野生大豆的耐碱特性,以50mmol·L-1 Na HCO3模拟碱胁迫,处理21日龄的野生大豆幼苗,检测了叶片中MDA、脯氨酸、可溶性糖、SOD、POD、CAT、和ROS 7个生理指标,在碱处理0h,6h,12h,24h和48h的累积量和活性变化。其中,MDA、脯氨酸和可溶性糖均于处理48h时达到最大累积量;SOD、POD和CAT三种酶活性分别于6h、24h和48h达到最高;ROS累积量在12h最高,48h时降低到正常水平。可见,野生大豆通过可溶性糖和脯氨酸的大量积累和SOD、POD、CAT三种酶的有序表达来抵抗碱胁迫。2.野生大豆叶片蛋白质组双向电泳体系的建立为建立分辨率高、重复性好的双向电泳体系,对Tris-饱和酚法、Tris-HCl法和TCA-丙酮法3种蛋白质提取方法提取的野生大豆叶片总蛋白的质量和效率进行了比较,并对蛋白上样量、等电聚焦参数及凝胶浓度进行了优化。最终建立了以Tris-饱和酚法提取蛋白质、上样量为2000μg、等电聚焦90000V·h、凝胶浓度为10%的双向电泳体系。利用该体系可获得背景清晰、蛋白点数较多、重复性较好的蛋白双向电泳图谱。3.碱胁迫下野生大豆叶片差异表达蛋白组的分析为获得野生大豆碱胁迫应答蛋白。利用上述双向电泳体系,对50mmol·L-1 Na HCO3胁迫0h、6h、12h、24h和48h的野生大豆叶片进行蛋白质的提取和双向电泳,为确保双向电泳重复性,每个处理时间至少3次重复。利用PDquest软件对凝胶进行分析,每两个处理时间点相比较,以fold1.5,P0.05为阈值筛选差异表达蛋白,共获得101个蛋白点发生了显著变化。差异蛋白点的分子量主要分布在20-60k D之间,等电点主要分布于5.6-6.0之间。几个时期中,处理24h和48h时得到了差异蛋白点最多,表明此时期胁迫响应系统最活跃。101个蛋白点在不同的处理时期共发生127次下调表达和52次上调表达,下调表达次数占总次数的71%。推测野生大豆可能通过降低自身代谢,减少能量消耗来抵抗碱胁迫的危害。


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