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miR-2400和EGR1对牛骨骼肌卫星细胞分化过程中MyoG基因表达调控

张伟伟  
【摘要】:肌肉的生长主要依赖骨骼肌卫星细胞的增殖分化,使肌纤维长度增加,周径增粗。肌细胞生成素(Myogenin,Myo G)是生肌调节因子(myogenic regulatory factors,MRFs)家族的成员之一,是骨骼肌发育和肌肉再生的关键调控因子,在骨骼肌细胞的形成过程中起中心调控作用。Myo G基因表达与出生后肌肉再生密切相关。鉴于Myo G基因在骨骼肌卫星细胞(skeletal muscle-derived satellite cells,MDSCs)分化过程中的重要作用,本研究从转录和转录后水平探讨Myo G基因在牛MDSCs分化过程中的表达调控机制。首先采用高通量深度测序(Hi Seq deep sequencing)技术进行了牛MDSCs分化过程中差异mi RNA和m RNA表达谱的测定,用实时荧光定量RT-PCR(q RT-PCR)技术验证了高通量测序结果。采用log2-ratio、Scatter plot法分析比较了不同分化阶段mi RNA和m RNA表达量的差异。利用生物学信息学方法分析表达谱结果中可能靶向作用于Myo G基因的mi RNA和转录因子,筛选出mi R-2400和转录因子EGR1为Myo G基因的候选调控因子。通过双荧光素酶报告基因实验、过表达和抑制、q RT-PCR、Western blot、Ed U、流式细胞术等技术,研究了mi R-2400对Myo G基因转录后水平的表达调控作用。运用免疫荧光(共聚焦)、cris PRi及慢病毒介导的EGR1过表达和干扰、q RT-PCR、Western blot、Ch IP等技术研究了EGR1在转录水平上对MyoG基因的表达调控作用。首次证实了mi R-2400和转录因子EGR1可调控牛MDSCs分化过程中Myo G基因的表达。研究结果将有助于进一步了解Myo G的分子调控机制,有助于深入了解其促进肌肉分化的作用机制,进而为提高肉产量、改良家畜遗传育种提供重要依据。具体研究结果如下:1.构建了牛MDSCs分化不同阶段差异mi RNA表达谱。在牛MDSCs增殖阶段(MDSC-P)、分化24 h(MDSC-D1)和分化72 h(MDSC-D3)三个不同分化阶段的RNA文库中共鉴定得到564个保守mi RNAs和53个候选mi RNAs。与MDSC-P相比,在MDSC-D1中表达上调的mi RNA有9个,表达下调的mi RNA有165个;在MDSC-D3中表达上调mi RNA有15个,表达下调的mi RNA有145个。与MDSC-D1相比,MDSC-D3中表达上调的mi RNA有17个,表达下调的mi RNA有54个。利用生物信息学预测到65个靶向作用于牛Myo G基因的mi RNA,这些mi RNA在差异mi RNA表达谱中表达变化倍数大于2的有12个,分别为:bta-mi R-122、bta-mi R-129-3p、bta-mi R-2450a、bta-mi R-331、bta-mi R-2398、bta-mi R-376b、bta-miR-196a、bta-miR-2400、bta-mi R-29a、bta-miR-155、bta-miR-28和bta-mi R-449a,其中miR-2400是牛中特异表达的mi RNA,因此本研究中选择mi R-2400作为调节Myo G基因表达的候选mi RNA.2.构建了牛MDSCs分化不同阶段差异m RNA表达谱。在MDSC-P、MDSC-D1和MDSC-D3中分别鉴定得到9924、10023和9948个mRNA。与MDSC-P相比,在MDSC-D1中表达上调的m RNA有9924个,表达下调的有2125个;在MDSC-D3中表达上调的mRNA有2508个,表达下调有2381个。与mdsc-d1相比,在mdsc-d3中表达上调的mrna有1243个,表达下调的有9948个。生物信息学预测myog基因启动子上结合的转录因子有myod、egr1、mef2、mef3、srf及mef-1,其中,egr1在mdsc-d3的表达比在mdsc-p中升高了10.49倍,是这些转录因子中表达变化最显著的,因此本研究选择egr1作为调节myog基因表达的候选转录因子。3.mir-2400对myog基因表达调控:利用qrt-pcr检测了mir-2400和myogmrna在mdscs分化不同时期的表达量,结果显示,随着分化程度的加深,mir-2400的表达量逐渐降低,而myog的mrna表达水平却逐渐升高,说明mir-2400的表达水平与myog基因表达水平呈反向趋势,为典型的mirna-靶基因互作关系。双荧光素酶报告基因实验进一步证实mir-2400能够结合到myog基因的3′-utr590-597bp处。这暗示着mir-2400能够负向调控myog基因的表达。通过转染pcdna3.1(+)-mir-2400和mir-2400-i,分别使mir-2400在mdscs过表达和抑制表达,结果表明,mir-2400过表达后牛mdscs内源性myog基因的表达显著下调;而抑制mir-2400表达后内源性myog基因的表达上调,这就证明mir-2400能够负向调控myog基因的表达。通过edu法、pcna免疫荧光、cck-8、流式细胞术检测mir-2400过表达和抑制表达后mdscs增殖情况,发现过表达mir-2400促进牛mdscs增殖,而抑制mir-2400表达减弱牛mdscs增殖,这进一步证实mir-2400能够负向调控myog基因的表达。mir-2400是内含子mirna,位于牛whsc1l1基因的第8个内含子中。crispri干扰实验结果表明干扰宿主基因whsc1l1转录后mir-2400表达也随着降低,两者变化规律一致。双荧光素酶报告基因实验表明mir-2400无单独启动子,结合crispri干扰实验,证实mir-2400是由宿主基因转录后的内含子加工而来,不是作为一个单独的基因进行转录合成。4.egr1对myog基因表达调控:qrt-pcr、westernblot和免疫荧光的检测结果表明,在mdscs分化过程中egr1基因的表达早于myog基因,即分化过程中egr1基因先表达升高,myog基因后表达升高,最后肌球蛋白重链(myosinheavychain,mhc)基因表达升高。在分化的第4d,egr1基因表达开始降低,随后myog基因和mhc基因的表达也逐渐降低。这说明egr1表达的变化总是先于myog基因表达的变化。免疫荧光结果表明,在细胞分化时,有部分的egr1转移入细胞核。这暗示着egr1有调控myog基因表达的物质基础。利用crispri和慢病毒介导的egr1干扰分别在转录水平和转录后水平上干扰egr1的表达,发现myog基因和mhc基因表达下降。而过表达egr1之后,myog基因和mhc基因的表达则升高。在细胞水平上,干扰egr1后,g1/g0期细胞比例降低,g2/m期细胞比例升高,增殖相关基因ccnd2和ccnb1表达升高;过表达egr1后,细胞增殖速率显著降低,g1/g0期细胞比例升高,s期细胞比例降低,并且增殖相关基因ccnd2和ccnb1表达降低。说明egr1表达的变化确实能够正向引起myog基因表达的变化。chip实验和定点突变实验结果证实egr1可结合到myog基因启动子区-211至-217位点。这些结果证实egr1可结合到myog基因启动子区,参与mdscs分化过程中myog基因的正向表达调控。结论:1.构建了牛MDSCs分化不同阶段差异mi RNA表达谱,靶向作用于牛Myo G基因的mi RNA有65个,表达升高倍数大于2的有12个,其中mi R-2400是牛中特异表达的mi RNA。mi R-2400靶向结合于Myo G基因的3′-UTR 590-597 bp处。过表达miR-2400下调Myo G基因的表达,促进MDSCs增殖;抑制mi R-2400则上调Myo G基因表达,减弱MDSCs增殖,可见mi R-2400负向调节Myo G基因的表达。2.构建了牛MDSCs分化不同阶段差异mRNA表达谱,结果显示在MDSCs分化过程中转录因子EGR1的表达量显著上调。在MDSCs分化过程中,EGR1基因先表达升高,Myo G基因后表达升高。EGR1可结合到MyoG基因启动子区,参与MDSCs分化过程中Myo G基因的正向表达调控。


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