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PTEN过表达下调PI3K/Akt信号通路抑制犬乳腺肿瘤细胞生长研究

孙冬冬  
【摘要】:PTEN基因是首个被发现的具有双磷酸酶活性的抑癌基因,介导多种信号通路调节细胞周期、细胞凋亡和细胞的侵袭与转移等。在多种肿瘤组织中,尤其是在恶性肿瘤都有PTEN基因的突变或缺失的情况。PTEN负调控的PI3K/Akt信号通路,在多种肿瘤中活性异常升高,促进细胞增殖、分化和加快细胞周期进程。因此,PTEN基因和PI3K/Akt信号通路被视为治疗肿瘤的重要靶点之一。犬乳腺肿瘤是犬类最常见疾病之一,其还是人类乳腺肿瘤的理想模型。鉴于以上因素,研究PTEN基因与PI3K/Akt信号通路在乳腺肿瘤治疗的价值,以PTEN基因为突破口探索乳腺肿瘤的基因治疗方法,进行了下列实验。本研究采用RT-PCR方法扩增犬PTEN基因CDS区全长片段,构建PTEN真核表达载体(pc DNA3.1-PTEN),使用脂质体转染法将pc DNA3.1-PTEN导入犬乳腺肿瘤细胞系(CHMp和CHMm),G418筛选转染细胞约2-3周。采用CCK-8检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR和Western blot检测PI3K/Akt信号通路及相关因子的基因和蛋白水平变化,探讨PTEN过表达对犬乳腺肿瘤细胞PI3K/Akt信号通路及相关因子和细胞增殖的影响。结果:1、RT-PCR和Western blot检测,转染PTEN基因的犬乳腺肿瘤细胞系的PTEN的mRNA和蛋白表达量显著高于对照组和空载体组(p0.05);2、细胞增殖检测,转染PTEN基因能显著抑制犬乳腺肿瘤细胞系增殖(p0.05),细胞凋亡检测,转染PTEN基因能促进犬乳腺肿瘤细胞系凋亡(p0.05);3、转染PTEN基因的细胞组的总Akt的mRNA和蛋白的表达量与对照组和空载体组无明显差异(p0.05),但是转染PTEN基因的细胞组的p-Akt(Ser473)的蛋白和m TOR的mRNA、蛋白的表达量较对照组和空载体组显著降低(p0.05);4、转染PTEN基因的细胞组抑细胞凋亡基因Bax、caspase-3、caspase-9的mRNA和蛋白的表达量较对照组和空载体组显著升高(p0.05),促细胞凋亡基因Bcl-2的mRNA和蛋白表达量较对照组和空载体组显著降低(p0.05);5、转染PTEN基因的细胞组的细胞周期相关基因Cyclin D1的mRNA和蛋白的表达量较对照组和空载体组显著降低(p0.05),P27kip的mRNA和蛋白的表达量较对照组和空载体组显著升高(p0.05)。综上所述,本实验成功构建了PTEN真核表达载体,并在犬乳腺肿瘤细胞系(CHMp和CHMm)中成功表达了PTEN,PTEN过表达能抑制犬乳腺肿瘤细胞的增殖、促进其凋亡。PTEN过表达能下调PI3K/Akt信号通路,进而调控该通路下游相关细胞凋亡、细胞周期因子的表达量,抑制犬乳腺肿瘤细胞的生长,为寻找乳腺肿瘤基因治疗新方法提供依据。


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