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产细菌素乳酸菌的筛选及细菌素的分离纯化和特性研究

王娜娜  
【摘要】:细菌素是由细菌核糖体合成的多肽或蛋白,对与产生菌亲缘关系较近的菌株有抑菌作用,而对产生菌本身不会造成影响。因具有安全、高效、无毒、无抗药性、在体内易被分解等优点,倍受人们的关注,因此将其作为食品防腐剂或添加剂应用于食品中也成为未来食品工业的发展趋势。我国是乳酸菌资源丰富的国家,对乳酸菌的研究应用也遍及各行各业,但有关乳酸菌细菌素的研究与国外相比起步较晚,且研究内容并不深入,有关细菌素作用机理的报道更是少之又少。因此,本课题主要开发新型细菌素,提高细菌素的产量,并对细菌素的作用机理进行初探。本课题首先以大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 25922)为指示菌,采用双层平板法从7株乳酸菌中筛选高产细菌素的菌株,然后通过响应面及单因素试验优化目标菌株产细菌素的培养基组分和培养条件,进一步通过饱和硫酸铵沉淀和SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析法纯化细菌素,并通过tricine-SDS-PAGE电泳估测纯化细菌素样品的分子量大小,最后研究细菌素样品的生物学特性,探索无细胞发酵上清液对大肠杆菌的作用方式,绘制抑菌谱。通过实验研究得到以下结果:从7株乳酸菌中筛选得到一株高产细菌素的菌株KLDS 4.0325,排除有机酸和过氧化氢的干扰后,对大肠杆菌仍具有较高的抑菌活性,但经蛋白酶处理后抑菌活性消失,因此确定起主要抑菌作用的物质是细菌素;通过菌体形态观察、生理生化鉴定及16S r RNA序列分析鉴定菌株KLDS 4.0325为乳酸乳球菌。对乳酸乳球菌KLDS 4.0325产细菌素的发酵培养基及培养条件进行优化,得出最优培养基配方为128.99 g/L蔗糖,17.59 g/L蛋白胨,10 g/L酪蛋白胨,10 g/L磷酸氢二钾,60 g/L碳酸钙,1.5 g/L硫酸镁,1.49 g/L抗坏血酸钠,1.5 g/Lβ-甘油磷酸钠,乙酸钠、氯化钠、硫酸锰各为1.0 g/L。最优培养条件为发酵培养基初始pH 7.0,培养温度33℃,120 r/min摇床培养20 h。分离纯化细菌素所需硫酸铵溶液饱和度为60%,阳离子交换层析法纯化细菌素的条件为p H 4.0的乙酸平衡缓冲液,0.4 m L/min的流速,0.4 mL上样量和215 nm波长,经tricine-SDS-PAGE电泳测定其分子量约为3.4 kDa。研究细菌素样品的生物学特性发现其对热稳定,在pH 2~10的范围有较高的稳定性,对蛋白酶敏感,但经淀粉酶处理后仍能保持较高的稳定性,这也说明该细菌素是蛋白类物质,并得出无细胞发酵上清液对大肠杆菌的作用方式为杀菌,通过绘制抑菌谱可知该细菌素样品对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑菌活性。结论为筛选得到一株高产细菌素的菌株KLDS 4.0325,并鉴定为乳酸乳球菌,通过对发酵培养基组分和培养条件的优化,细菌素效价可达5000 IU/m L,较优化前提高了3.31倍,经分离纯化后比活力为51.02 IU/mg,较纯化前提高了约18倍,且对热稳定,耐酸碱,对蛋白酶敏感,能抑制常见革兰氏阳性和革兰氏阴性致病菌,无细胞发酵上清液对大肠杆菌的作用方式为杀菌,这也为该细菌素的工业化生产及应用奠定了基础。


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