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Streptococcus thermophilus TF96生长过程中胞内代谢特征与氨基酸利用模式研究

翟爽  
【摘要】:嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)作为发酵剂被广泛的用于乳制品的生产。目前,嗜热链球菌在乳品加工业中主要以直投式干粉发酵剂的形式被应用。直投式发酵剂制备的关键技术环节之一是乳酸菌的高密度培养,嗜热链球菌在高密度培养过程中主要经历两个方面的压力因素,即不断下降的胞内p H和胞外逐渐增加的乳酸钠浓度,这两个压力因素直接影响嗜热链球菌的生长和高生物量的获取。本论文主要研究了嗜热链球菌在化学合成培养基中进行培养时嗜热链球菌胞内生理状态的变化及氨基酸消耗模式和需求模式的变化,为后续的组学研究奠定基础,并为嗜热链球菌的高密度培养基的设计提供理论基础。本研究以Streptococcus thermophilus TF96为目标菌株,在化学合成培养基中对其进行增殖培养,分析了Streptococcus thermophilus TF96的生长动力学,在此基础上利用现代分析技术研究了Streptococcus thermophilus TF96在发酵过程中关键时间点上的胞内p H和胞外乳酸钠浓度的变化;利用试剂盒法和高效液相色谱技术分析了胞内ATP、H+-ATP酶活性、NADH、NADPH和NH4+浓度的变化规律;利用氨基酸分析技术研究了Streptococcus thermophilus TF96在培养过程中氨基酸的消耗模式与需求模式。Streptococcus thermophilus TF96于化学合成培养基中,在控制p H进行培养时,其胞内p H逐渐降低,从对数生长期初期(2.3h)的6.43降低至稳定期(9h)的5.92;胞外乳酸钠浓度逐渐升高,从对数生长期初期(2.3h)的89.45×10-4mol/L升高到稳定期(9h)的199.77×10-4mol/L。Streptococcus thermophilus TF96在两种压力下生长,其胞内生理学指标均发生变化。测得的Streptococcus thermophilus TF96胞内ATP含量和H+-ATP酶活性随胞内H+浓度的增加而逐渐升高,在2.3h时,ATP含量(12.08μmol/gprot)显著高于其他时间点的ATP含量,在4.7~9h从2.20μmol/gprot升高到6.65μmol/gprot;在2.3h处的H+-ATP酶活性(0.67μmol/mgprot/hour)也显著高于其他时间点的H+-ATP酶活性,在4.7~9h其活力从0.13μmol/mgprot/hour升高到0.40μmol/mgprot/hour;其胞内NADH和NADPH的含量是随着胞内H+浓度的增加而逐渐降低,在2.3h时,胞内NADH含量较低,在4.7~9h时其含量从5.93nmol/107细胞降低到3.95nmol/107细胞;在2.3h处的胞内NADPH含量也较低,在4.7~9h时其含量从2.07nmol/107细胞降低到1.07nmol/107细胞;其胞内NH4+的含量逐渐升高,在4.7~9h时其含量从16.74 mg/L升高到36.78 mg/L。实验结果表明Streptococcus thermophilus TF96为了适应在不断降低的胞内p H和逐渐增加的乳酸钠浓度下生长,Streptococcus thermophilus TF96对胞内的生理学状态作出了相应的调节以保持其生长状态。Streptococcus thermophilus TF96氨基酸消耗模式随生长率变化的研究结果表明,在整个生长过程中,氨基酸消耗量最大的是Asx(天冬氨酸和天冬酰胺)、Glx(谷氨酸和谷氨酰胺)、丝氨酸和精氨酸,其中Asx(天冬氨酸和天冬酰胺)、Glx(谷氨酸和谷氨酰胺)和丝氨酸分别占氨基酸消耗总量的17.15%、18.73%和13.37%,而精氨酸的消耗量占培养基中精氨酸添加量的98%;其次,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸的消耗量占氨基酸消耗总量的3%~10%,而剩余氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、组氨酸和脯氨酸)消耗量较低。在平均生长率为μ1=0.12h-1时,细胞处于调整阶段,所以所有氨基酸消耗量均显著高于其他时间点的氨基酸消耗量,而在平均生长率为μ2=0.36h-1,μ3=0.52h-1,μ4=0.08h-1时,氨基酸的消耗量随μ的增加而增加。试验结果表明Streptococcus thermophilus TF96为了适应在不断降低的胞内p H和逐渐增加的乳酸钠浓度下生长,调整菌体氨基酸的消耗量来使菌体更好的生长。Streptococcus thermophilus TF96氨基酸需求模式随生长率的变化结果表明,随着μ的增加,氨基酸的需求量发生显著变化,需求量最大的氨基酸有Asx(天冬氨酸和天冬酰胺)、Glx(谷氨酸和谷氨酰胺)和赖氨酸,其需求量分别占氨基酸需求总量的14.41%,15.64%和10.37%;其次,苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的需求量占需求总量的4%~8%,而剩余氨基酸(缬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸和精氨酸)需求量较低。当平均生长从μ1=0.12h-1到μ2=0.36h-1时,氨基酸需求量显著增加,当平均生长率从μ3=0.52h-1到μ4=0.08h-1时,氨基酸需求量也显著增加。试验结果表明Streptococcus thermophilus TF96受到双重压力下,氨基酸合成各种应急蛋白来调节菌体状态。在Streptococcus thermophilus TF96培养过程中,氨基酸消耗总量为37.31mmol/gdw,其生物需求量为13.24mmol/gdw,氨基酸的消耗量明显高于其生物合成需求量,约2.8倍,这说明菌体生长过程中消耗掉培养基中的氨基酸并不是全部用来菌体自身的生长,存在一定的氮浪费现象。而氮浪费可能主要是因为Asx(天冬氨酸和天冬酰胺)、Glx(谷氨酸和谷氨酰胺)、丝氨酸和精氨酸的过量消耗造成的。上述研究内容阐明了Streptococcus thermophilus TF96在培养过程中胞内生理学状态及氨基酸的消耗模式与需求模式是如何随胞内p H的逐渐降低与胞外乳酸钠浓度的不断增加情况下的变化规律。


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