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miR-181a对牛骨骼肌卫星细胞分化的影响

朱新峰  
【摘要】:Micro RNA是一类是基因表达的重要调控因子,属于非编码的小RNA分子,具有调控细胞增殖、分化和凋亡的机理功能。过去人们常常在转录水平上研究肌肉基因表达,最近发现miRNA可以作为转录后调控分子,在骨骼肌发育中具有一定的调控作用,让人们对肌肉发育有着更深刻的理解。本次研究转录后水平探讨miRNA在牛骨骼肌卫星细胞分化过程中的表达调控机制。在用高通量深度测序(HiSeq deep sequencing)技术对牛骨骼肌卫星细胞分化过程中不同时间不同miRNA进行测序时,发现miRNA-181a在牛骨骼肌卫星细胞分化过程中表达量明显升高。我们推测该micro RNA可能参与了对牛骨骼肌卫星细胞分化的调控作用。我们用实时荧光定量RT-PCR(q RT-PCR)技术对分化不同时期的miRNA-181a表达量进行了测定,发现与高通量测序结果一致。所以本实验就以miR-181a作为研究对象,探究miR-181a在牛骨骼肌卫星细胞的作用。利用生物学信息学方法分析miRNA-181a可能的靶基因,经过分析发现HOX-A11可能是其中一个靶基因。通过双荧光素酶报告系统实验、免疫荧光,模拟物和抑制剂、q RT-PCR、Western blot等技术,研究了miR-181a对HOX-A11以及有关分化相关基因转录后水平的表达调控作用。通过实验发现miRNA-181a可以靶向HOX-A11进而对牛骨骼肌卫星细胞分化产生调控作用。HOX-A11是一种能够抑制细胞的分化基因。miRNA-181a在牛骨骼肌卫星细胞分化的影响,对增加经济价值具有重要的指导意义。实验结果如下:在牛骨骼肌卫星细胞中,用Real-time PCR检测不同时间miR-181a表达量,随着时间增长,miR-181a的表达量极显著增加。通过用免疫荧光的方法,检测细胞的中的结蛋白进而统计肌管数量,发现转染miR-181a-M模拟物的肌管的数量比miR-181a-M-NC对照组显著增加,转染miR-181a-I抑制剂的比miR-181a-I-NC对照组显著降低,我们从形态学上更能直观看到miR-181a对牛骨骼肌卫星细胞分化的促进作用。转染miR-181a-M模拟物的牛骨骼肌卫星细胞,有关肌肉分化蛋白质如Myo D,Myo G和MYH3的表达量明显增加,而转染miR-181a-I抑制剂的,表达量明显降低,进一步证实miR-181a能够促进细胞的分化。在双荧光素酶报告系统中,miRNA-181a能够和HOX-A11基因的3′-UTR结合时,荧光素酶活性明显下降,miRNA-181a和突变的3′-UTR结合时,荧光素酶活性没有下降,进一步说明HOX-A11是miR-181a的靶基因。用Western blot检测不同时期靶基因HOX-A11蛋白表达量,随着时间的增长,HOX-A11蛋白的表达逐渐降低。说明miR-181a的表达水平与HOX-A11基因蛋白表达水平呈反比关系,为常见的miRNA-靶基因互作关系。在牛骨骼肌卫星细胞中,转染miR-181a-M模拟物的HOX-A11蛋白表达量明显下降,转染miR-181a-I抑制剂HOX-A11蛋白表达量明显上升,这说明miRNA-181a能够负向调控HOX-A11基因的表达。


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