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干酪乳杆菌噬菌体抗性菌株抗性机制研究

于美玲  
【摘要】:乳杆菌是公认的食品安全级微生物,具有调节机体免疫、维持肠道微生态环境、降低胆固醇、抗肿瘤、抗高血压等多种益生功能。干酪乳杆菌发酵产生大量风香味物质,常用于乳、肉、饲料和蔬菜等发酵工业,该菌亦可作为基因工程疫苗活菌载体,用于制备黏膜疫苗和表达多种功能蛋白等生物制剂。在乳杆菌疫苗生产和食品发酵中,都需要培养大量的乳杆菌,而乳杆菌烈性噬菌体的感染,可以裂解细菌,导致细菌死亡、活菌数下降、发酵生产效率降低,甚至导致生产失败,给乳杆菌发酵生产工业带来巨大损失。有效防止乳杆菌噬菌体污染,筛选噬菌体抗性菌株和研究乳杆菌抵抗噬菌体侵染裂解的机制具有重要的理论与实践意义。本研究以实验室分离的干酪乳杆菌L.casei W56的烈性噬菌体LJ为材料,对其进行全基因组分析,研究其基因特征,从基因水平分析噬菌体感染特性。以噬菌体LJ为筛选压力,采用次级感染方法筛选获得了干酪乳杆菌噬菌体抗性菌株,并对抗性菌株进行了相关生物学研究。为工业发酵和生产提供抗噬菌体的轮换菌株,减少因噬菌体感染而造成菌体死亡和发酵失败,从而提高经济效益;通过分析抗性菌株的溶源性,明确抗性菌为溶源菌。通过分析噬菌体与抗性菌株相互作用的过程,明确抗性菌抑制噬菌体DNA注入和DNA复制。通过转录组测序,明确了噬菌体侵染抗性菌株和敏感菌株的差异表达基因。通过过表达差异基因,验证差异基因功能,探讨了乳酸菌对噬菌体的抗性机制,为利用基因重组技术和基因克隆技术对工业用菌株进行噬菌体抗性改善提供理论依据。主要研究内容及结果如下:(1)对干酪乳杆菌噬菌体LJ进行基因组分析,结果显示,噬菌体基因组全长为44260bp,GC含量百分比是44.83%,LJ基因组共有65个开放阅读框,噬菌体LJ与干酪乳杆菌噬菌体A2亲缘关系最近,噬菌体LJ基因组按照功能基因模块排序,包括复制模块(LJ1-LJ9)、调控模块(LJ10-LJ33)、装配模块(LJ34-LJ36)、结构基因模块(LJ37-LJ52)、裂解模块(LJ53-LJ56)和溶源模块(LJ57-LJ65)。分析LJ具有裂解周期和溶源周期。(2)以噬菌体LJ感染L.casei W56后,获得20个噬菌体抗性菌株,命名为BIM1-20。对抗性菌的特性分析结果显示,抗性菌在菌体形态、生化特性、培养特性、发酵特性和基因型与敏感菌一致,仍为干酪乳杆菌。抗性范围测定结果表明,抗性菌BIM1-20可抵抗干酪乳杆菌噬菌体LJ、LL和Lcb的裂解,对噬菌体LJ具有完全抗性,且抗性具有遗传稳定性。(3)对抗性菌BIM1-20进行溶源性分析,BIM1-20均可释放裂解L.casei W56的噬菌体颗粒,丝裂霉素和紫外射线不能诱导BIM1-20释放噬菌体颗粒。对BIM1进行噬菌体基因检测和整合位点分析,结果表明抗性菌BIM1为溶源菌,是噬菌体LJ DNA环化后于39625bp-39626 bp处断裂,然后整合到L.casei W56基因组1982081-1982082 bp处,整合位点序列有14 bp核心序列ATGCCGGCTGCAGG,attP位于噬菌体整合酶与裂解素之间,attB位于L.casei W56基因组tRNA-Thr基因附近。(4)分析抗性菌与噬菌体的相互作用,结果表明细菌与噬菌体作用后,抗性菌未利用CRISPR和限制修饰防御系统抵抗噬菌体侵染;分析噬菌体侵染敏感菌和抗性菌作用过程结果显示:噬菌体依然可以吸附抗性菌,吸附率与敏感菌相似。抗性菌株可抑制噬菌体DNA注入。抗性菌可抑制噬菌体增殖释放,抵抗噬菌体裂解菌体,特别是抗性菌在15 min时调控噬菌体复制模块基因的转录。初步分析抗性菌通过抑制噬菌体DNA注入,影响噬菌体复制模块基因的表达,起到抑制噬菌体裂解细菌的作用。(5)噬菌体侵染细菌15 min时,收集样品进行转录组测序,寻找噬菌体侵染敏感菌及抗性菌差异表达基因,进一步分析抗性菌抑制噬菌体DNA注入、影响噬菌体复制模块基因的表达的机制。对转录组测序结果分析,S-VS-R显著差异表达细菌基因共有95个,其中59个为上调基因,36个为下调基因。SA-VS-RA显著差异表达细菌基因共有156个,其中112个为上调基因,44个为下调基因。抗性菌添加噬菌体时细菌甘露糖通透酶基因和PTS系统甘露糖特异性EIIAB单位基因表达量显著下降;细菌HTH型转录调节因子、氧化还原敏感性转录调节因子和GntR家族转录调节因子及操纵子基因表达水平显著上调;噬菌体阻遏蛋白等溶源基因表达量显著上调,噬菌体复制基因等前期表达基因的表达量显著下调。显著差异表达基因KEGG富集到的通路主要是代谢通路、环境信息处理通路以及细胞过程通路,主要包括果糖-甘露糖代谢、脂肪酸代谢、嘌呤代谢、嘧啶代谢、PTS磷酸转移酶系统和双成分系统。显著差异表达基因GO功能分析结果表明代谢过程、生物过程、细胞膜成分、转录因子活性和催化活性等GO功能条目对噬菌体抗性菌株抵抗噬菌体裂解具有重要作用。(6)对差异表达基因进行实时荧光定量PCR,分析细菌和噬菌体差异基因的表达情况。实时荧光定量PCR反应结果中基因表达情况与转录组测序结果中基因表达情况相符。利用过表达方法,验证细菌PTS磷酸转移酶系统和噬菌体溶源基因在噬菌体抗性菌株抵抗噬菌体裂解过程中的作用。构建重组乳杆菌表达系统,利用抗性菌表达pts基因,利用敏感菌表达噬菌体溶源基因。Western-bolt和间接免疫荧光证明重组菌表达细菌PTS蛋白、噬菌体阻遏蛋白CⅠ、膜蛋白M和抗阻遏蛋白Cro-ant。检测重组乳杆菌对噬菌体的敏感性,测定噬菌体侵染重组菌时细菌的生长曲线和噬菌体的一步生长曲线。结果表明表达CⅠ和M的敏感菌可抵抗噬菌体裂解,表达Cro-ant的抗性菌生长缓慢。RT-qPCR检测噬菌体侵染重组乳酸菌时细菌和噬菌体基因表达水平,结果表明:与噬菌体侵染pPG-PFT/S相比,噬菌体侵染pPG-PFT-CⅠ-M/S时,噬菌体复制模块基因、裂解基因表达量显著下降,整合酶等溶源基因表达量显著增加,细菌PTS系统相关基因表达水平变化显著,细菌转录调节因子基因表达水平显著提高,代谢相关基因表达水平显著提高,细胞周期调节基因表达水平显著提高。说明过表达CⅠ和M蛋白可使细菌通过提高代谢、调节转录、调节细胞周期和改变PTS系统信号转导和膜运输等途径抵抗噬菌体裂解菌体,证明cⅠ和m基因是抗性菌抵抗噬菌体侵染裂解的关键基因。本研究对噬菌体的鉴定和对分离到的抗性菌的特性及抗性机制的研究为制备优良的抗噬菌体乳酸菌株提供了物质基础,为工业生产中实施有效的防御噬菌体污染的措施提供了理论依据。


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