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镉暴露通过miR-103靶向FoxO调控鲤鱼脾细胞凋亡和自噬的研究

陈俭清  
【摘要】:镉(cadmium,Cd)是一种具有毒性的重金属,人类活动造成镉污染不断加剧。因此,镉污染成为人们关注和研究的热点。各种形式的镉污染都会随着降水和地表径流汇聚到天然水体中,水体中富集的镉会在水生动物体内累积,造成动物机体的损伤,并通过食物链,最终影响人类健康。鲤鱼是世界上分布最广的鱼类之一,可以作为环境污染的生物标志物。Micro RNA(miRNA)是一种非编码RNA,参与动物基因的转录后调控。近年来研究发现,miRNA参与一些环境污染物中毒的调控,被认为可以作为环境污染的潜在分子标记。然而,miRNA在调控镉暴露引起鲤鱼脾组织细胞凋亡和自噬发生中的机制报道较少,因此,本项目通过体内试验和体外试验,研究镉暴露诱导miRNA调节鲤鱼脾组织细胞凋亡和自噬的机制。将162尾健康鲤鱼分为2组(对照组和镉处理组),鲤鱼镉中毒模型水中镉浓度为0.26mg/L Cd(96 h LC_(50)的1/25)。分别在鲤鱼镉暴露的10 d、20 d和30 d采集脾组织样品。采用显微结构和超微结构观察,转录组学测序,生物信息学技术分析,预测miR-103与FoxO的靶向关系并参与鲤鱼脾组织细胞凋亡和自噬的调控;进一步通过TUNEL检测,氧化应激和炎症指标测定,实时荧光定量PCR(RT-q PCR)和免疫印迹(western blot,WB)等方法检查鲤鱼脾组织细胞凋亡和自噬相关通路基因和蛋白表达,以研究鲤鱼镉暴露引起的脾组织细胞凋亡和自噬的机制;通过体外试验,对鲤鱼上皮(EPC)细胞镉暴露CCK-8试验确定镉浓度,双荧光素酶报告基因试验验证miR-103与FoxO的靶向关系,通过EPC细胞镉暴露1 h、6 h和12 h进行氧化应激和炎症指标测定,miR-103的敲低和过表达试验,AO/EB染色,流式细胞术,MDC/EB染色,RT-q PCR和WB等方法检测凋亡和自噬及相关通路基因和蛋白的表达,以研究鲤鱼EPC细胞凋亡和自噬的机制。主要研究结果如下:(1)通过观察鲤鱼镉中毒模型,发现镉处理组鲤鱼体表颜色变浅,在水中游泳路线杂乱无规律,精神沉郁,采食量下降,镉暴露显著抑制鲤鱼生长。病理组织切片观察发现,对照组健康鲤鱼脾组织红髓面积大于白髓面积,红髓和白髓的边界不明显,脾组织着色均匀。在鲤鱼镉处理10 d,脾组织红髓面积减小,白髓面积变大,出现淋巴细胞聚集和血管内皮细胞纤维素样肿胀。在镉处理20 d和30 d,除上述病理变化外,同时出现了出血和血铁黄素。而且在镉处理30 d,鲤鱼脾组织出现了空泡。通过电子显微镜观察发现,鲤鱼镉处理10 d、20d和30 d,部分细胞的细胞核形态不规则,发生皱缩,细胞浆致密,染色质边集,部分细胞内容物被膜包裹形成凋亡小体。同时部分脾细胞形态不规则,细胞内出现了大量的自噬体和自噬溶酶体。这些结果表明,鲤鱼镉暴露能够引起脾组织炎性损伤,脾组织细胞凋亡和自噬。(2)鲤鱼镉暴露30 d,对脾组织进行转录组测序。miRNA测序,发现23个miRNA差异表达,其中17个miRNA显著上调和6个miRNA显著下调。m RNA测序发现3794个m RNA差异表达,其中1848个m RNA显著上调和1946个m RNA显著下调。通过生物信息学技术,预测23个miRNA靶向调控2022个差异表达的m RNA,其中1113个m RNA下调和909个m RNA上调。通过GO和KEGG分析发现镉通过miRNA调控基因参与了鲤鱼脾组织功能的调控。(3)通过生物信息学预测发现FoxO可能是miR-103的靶基因。通过双荧光素酶基因报告试验证实miR-103靶向调控FoxO。进一步通过敲低和过表达miR-103后靶基因FoxO的m RNA和蛋白表达进行验证,证实FoxO是miR-103的靶基因。(4)鲤鱼镉暴露10 d、20 d和30 d和鲤鱼EPC细胞镉暴露6 h和12 h,脾组织和EPC细胞的GSH含量和CAT、GSH-Px、GST、SOD和T-AOC活性降低;H_2O_2、MDA和NO含量及i NOS活性升高,氧化应激和炎症与镉暴露时间呈正相关。通过RT-q PCR试验发现鲤鱼脾组织细胞CAT、GSH-Px和HO-1a的m RNA表达显著下调;CYP26B1、COX-2和PTGE的m RNA表达显著上调。表明镉暴露引起氧化应激和炎症反应。(5)鲤鱼镉暴露10 d、20 d和30 d和鲤鱼EPC细胞镉暴露6 h和12 h,通过RT-q PCR试验发现脾组织和EPC细胞Fox P3、TGF-β、T-Bet和IFN-γ的m RNA表达显著下调;GATA3和IL4/13A的m RNA表达显著上调,表明发生了免疫抑制。(6)通过敲低EPC细胞的miR-103,并用凋亡抑制剂z-VAD-FMK处理细胞,结果显示敲低miR-103细胞凋亡率明显升高,可被凋亡抑制剂z-VAD-FMK抑制。过表达miR-103能够降低镉处理EPC细胞引起的细胞凋亡。以上试验结果表明镉暴露引起miR-103表达下调,减弱了对FoxO的负调控,进一步通过RT-q PCR和WB试验发现凋亡相关通路基因和蛋白Bim、Cyt c、caspase9和caspase3表达上调,表明miR-103靶向FoxO引起线粒体氧化应激,导致EPC细胞凋亡。鲤鱼镉中毒脾组织RT-q PCR和WB试验发现凋亡通路相关基因和蛋白FoxO、Bim、Cyt c、caspase9和caspase3表达上调,表明镉能够引起鲤鱼脾组织细胞凋亡。(7)通过敲低EPC细胞的miR-103,并用自噬抑制剂3-MA处理细胞,结果显示敲低miR-103细胞自噬率明显升高,并可被自噬抑制剂3-MA抑制。过表达miR-103能够降低镉处理细胞引起的细胞自噬率。进一步通过RT-q PCR和WB试验发现自噬通路相关基因和蛋白FoxO、Beclin1、LC3-I和LC3-II的表达上调,表明miR-103靶向FoxO引起鲤鱼EPC细胞自噬。鲤鱼镉中毒脾组织RT-q PCR和WB试验发现自噬通路相关基因和蛋白FoxO、Beclin1、LC3-I和LC3-II表达上调,表明镉能够引起鲤鱼脾组织细胞自噬。综上,鲤鱼镉暴露抑制鲤鱼生长。通过形态学发现镉能够引起鲤鱼脾组织细胞的凋亡和自噬。采用转录组学测序发现镉暴露引起脾组织miRNA和m RNA发生差异表达,通过生物信息学分析发现miR-103可能靶向FoxO调控脾组织细胞的凋亡和自噬。通过鲤鱼EPC细胞双荧光素酶基因报告试验证明miR-103和FoxO靶向关系成立。进一步试验证明脾组织和EPC细胞镉暴露能够诱导氧化应激、炎性、免疫反应、凋亡和自噬。其中凋亡和自噬相关通路基因和蛋白Bim、Cyt c、caspase9、caspase3、Beclin1、LC3-I和LC3-II表达上调。本研究证明镉暴露通过miR-103靶向调控FoxO引起脾组织细胞的凋亡和自噬。


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