乳酸菌胞外多糖生物合成及生理功能特性的研究

【摘要】： 具有独特生理功能的乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）极具研究和开发价 值。本文以筛选的唾液链球菌嗜热亚种LCX2001为EPS生物合成的生产菌株，对EPS的 生物合成、分离纯化、结构分析及生理功能特性等进行了系统的研究，主要研究结果如 下： 经比较研究发现硫酸-苯酚法较适合于乳酸菌EPS检测，该方法的平均相对误差为 0.2％，具有较好的准确性。 从43株乳酸菌中，经发酵比较，筛选出一株高产EPS乳酸菌—唾液链球菌嗜热亚 种LCX2001。 为了研究唾液链球菌嗜热亚种EPS生物合成，从常用于乳酸菌生长的合成和半合成 培养基中，选择了ATP作为唾液链球菌嗜热亚种LCX2001生物合成EPS的基本培养 基，并对碳源、氮源、盐、培养基的初始pH等对该菌株EPS生物合成的影响进行了研 究。从而开发出用于唾液链球菌嗜热亚种EPS生物合成研究的新型合成培养基（命名为 LCX），该培养基的组成为：蛋白胨，1.5％；胰蛋白胨，1.0％；葡萄糖或乳糖，2.0％； K_2HPO_4，0.2％；MgSO_4，7H_2O，0.02％；MnSO_4，4H_2O，50mg/L；Tween 80，1mL/L；醋酸 钠，0.5％；甘油磷酸钠，1.9％。培养基初始pH值为6.5。 研究结果表明唾液链球菌嗜热亚种LCX2001在LCX培养基中生物合成EPS的最适 条件为：接种量2.0％，发酵温度35℃，发酵时间20h。 为了进一步提高EPS的生物合成量，比较了新型发酵技术—等pH值发酵法和连续 流加发酵法对EPS生物合成的影响，发现两种发酵法均能提高该菌株的EPS生物合成 量。等pH值发酵时，控制pH值在5.5时，最大合成量达到347mg/L。而连续流加发酵 法，最大合成量达到638mg/L。 Logistic-equation方程和Luedeking-piret方程对唾液链球菌嗜热亚种LCX2001分批 发酵生物合成EPS过程得到了很好的理论描述，通过研究建立了细菌生长、乳酸生成和 底物消耗（乳糖）相关的动力学模型参数，阐述了该菌发酵的动力学特征。 采用回归正交旋转设计对利用黄浆水生产EPS进行了研究。经研究发现实验所选择 的三因素（pH值、温度和蛋白胨添加量）是影响EPS生物合成的主要因素，且回归模 型是有效的，与实际情况拟合较好。在三因素中，pH值是影响EPS产量的最主要因素， 其次是温度和蛋白胨添加量。回归模型对实际生产具有指导意义。 通过研究，确定乳酸菌EPS提取条件为：发酵液在500rpm下，搅拌30min，浓缩 至原体积的1/5，并调整pH值为6.5，采用70％的乙醇浓度；在-25℃下，3h或4℃下 12h进行沉淀；离心力为10000g。 经提取分离得到的粗多糖，采用凝胶色谱法进行纯化，纯化条件为：色谱柱为 Sepharose CL-6B，上样体积为10mL，样品浓度为40mg/mL，洗脱剂的流速为30mL/h。 — — 凝胶色谱法测得Epsl和EpSZ的分于量分别为 1．ZX10吁3．SX10‘，经硫酸水解后，用 HpLC测得 Ep引的单糖组成为葡萄糖和半乳糖，摩尔比为 l：4，红外光谱和核磁共振 分析表明，EPS为p端基差向异构体，并对结构进行了推测。 不同EPS产生量的两种乳酸菌，用于酸乳的生产，在四种不同菌株组合形式的发酵 乳中，球、杆菌比例和乳糖消耗基本一致，但是在粘度、EpS产生、EpS的单糖组成、 对乳清析出的影响，以及感官等方面，均有区别。实验结果表明，在酸乳生产中，以产 EPS的德氏乳杆菌保加利亚亚种和唾液链球菌嗜热亚种组合较好。 以四株有荚膜或无荚膜，以及荚膜大小不同的唾液链球菌嗜热亚种，它们的产酸、 抗胆汁酸盐和低 pH值耐受能力，与荚膜无关。但对有荚膜的唾液链球菌嗜热亚种 LCX200的研究发现，荚膜的破坏，会使发酵速度加快，但同时对外界不良环境的抵抗 力下降。这些研究结果表明：有、无荚膜和荚膜大小对同一亚种所表现出来的不同生理 特性没有决定作用；破坏荚膜，会影响细胞体与外界物质交换能力，对细胞体许多生理 功能有影响；荚膜起到阻止外界物质进入细胞和细胞内产生的乳酸向外界释放的作用。 急性毒性试验表明，EpS安全无毒。EpS具有明显提高小鼠的游泳耐力和抗缺氧能 力。免疫学特性研究表明，EpS对小鼠的细胞和体液免疫功能均具有促进作用。乳酸菌 EpS可使实验鼠全血中的 SOD活性提高引％，使肝组织中的 LpS含量降低 24％。体外 试验表明，乳酸菌 EPS对试验的几株病原菌没有抑制作用，但具有促进双歧杆菌和嗜酸 乳杆菌生长的作用，且具有调节小鼠肠道菌群作用。