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黄瓜抗真菌基因遗传转化体系的研究

侯爱菊  
【摘要】: 黄瓜在我国蔬菜周年供应上占有重要地位,但易受多种真菌病害的危害而使产量降 低,品质下降。传统的育种方法周期长、耗资大、效率低、受抗性基因资源匮乏的限制、 还易出现抗性退化的现象,且黄瓜具有严重的有性杂交不亲和障碍,用这种方法很难得 到具有抗性的优良品种。因此,本研究通过基因工程手段,利用农杆菌介导法首次将抗 真菌基因(菜豆几丁质酶基因)导入黄瓜,建立了黄瓜高效的植株再生体系和遗传转化 体系,探讨了影响植株再生频率和遗传转化效率的主要因素,确立了最佳的植株再生和 遗传转化条件,获得了阳性转基因植株。主要研究结果如下: 1 外植体和基因型对器官发生的影响 子叶节是最佳的外植体;最适宜的芽诱导 培养基为MS+6-BA1mg/L;基因型对再生频率影响差异极显著,再生频率最高的是“长 春密刺”,为93.2%,其次是“叶三旱黄瓜”,为40.1%,“老来少”最低,为10.6%。 2 蔗糖浓度对体细胞胚胎发生的影响 较高的蔗糖浓度有利于胚胎发生。胚性愈 伤诱导最适宜的蔗糖浓度为9%;6%的蔗糖有利于胚的形成和萌发。 3 基因型及PGR对体细胞胚胎发生的影响 “叶三旱黄瓜”胚形成率最高,达 67.1%,而“长春密刺”及“老来少”几乎无胚的形成。胚诱导培养基中的PGR对胚的 形成也有影响,最适宜的PGR配比为NAA0.5mg/L、6-BA0.5mg/L。 4 黄瓜遗传转化的最适宜条件 子叶节预培养1-2天,真空侵染5分钟,在含有 6-BA1mg/L、乙酰丁香酮(AS)100μmol/L、pH5.2的MS培养基上进行培养,遗传转化 效率最高。最佳的选择压力为卡那霉素30mg/L。 5 转基因植株的检测 分别用两对引物对To代再生植株进行PCR检测,结果“长 春密刺”的88株再生植株中,有50株为阳性,占再生植株的56.82%,以起始外植体计 算,阳性率为3.84%;“叶三旱黄瓜”14株再生植株中有10株为阳性,占再生植株的 71.43%,以起始外植体计算,阳性率为3.09%。PCR检测结果可初步证明目的基因已整 合到黄瓜基因组中。


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