抗真菌病基因对葡萄植物遗传转化的研究

【摘要】：葡萄生产一直是我国农业生产的一个重要的组成部分。近年来我国的葡萄栽培面积迅速扩大，葡萄生产发展迅速但病虫害种类也随之增多，尤其是真菌病害发病十分严重。植物基因工程近些年来发展迅速，利用基因工程技术培育抗病虫害作物新品种已成为作物育种的一个有效手段。葡萄遗传转化中已有许多可以利用的目的基因，但对葡萄进行遗传转化较困难，主要存在以下问题： 1．葡萄再生频率低是造成葡萄遗传转化困难的关键所在，器官发生易产生嵌合体，胚状体诱导不仅过程繁琐、漫长、诱导率低，而且受基因型的限制，仅少部分葡萄品种能产生体细胞胚。 2．对葡萄进行遗传转化较困难，迄今为止在葡萄中仅获得了较少的转基因植株，且导入的基因多为报告基因。 3．共培养及共培养后受体材料容易产生坏死，因此限制了农杆菌法转化的进行。 4．在筛选过程中，用卡那霉素对葡萄组织筛选选择效果不佳。 本研究针对葡萄遗传转化中存在的上述问题进行研究，采用欧洲种葡萄Semillion作为试材，建立其高效植株再生体系，并采用农杆菌介导法及基因枪法进行抗真菌病基因的遗传转移，探讨影响基因转移效率的主要因子，优化遗传转化条件，得到PCR检测阳性植株，为从根本上解决真菌病害，得到葡萄抗真菌病的转基因植株奠定了坚实的基础。本研究主要内容如下： 1．建立了体细胞胚胎发生途径植株再生体系。利用欧洲种葡萄Semillion的胚性愈伤组织，诱导体细胞胚胎发生，综合考虑三方面因素——体细胞胚萌发率、萌发的幼苗中完整植株的比率及畸形苗比率，将Nitsch+BA0.2mg／L+NAA0.02mg／L确立为最适合体细胞胚萌发培养基。生根培养基确立为附加0.04mg/LNAA的Nitsch培养基。 2．建立了悬浮培养体系。胚性细胞团悬浮培养最适培养基为ND培养基，在继代后4天将细胞团经孔径1mm的钢质筛网多次过滤处理，可以使体细胞胚胎发生的整齐度大大增强。经过筛处理的细胞团，在Nitsch培养基中培养5周后子叶型胚的比率可以高达92.1％，而且再生苗的畸形苗的百分率下降至38.5％。再生阶段最适培养基为附加1g／L活性炭的Nitsch培养基，活性炭的添加对减少畸形苗的发生是有利的。 3．绘制了胚性悬浮培养细胞生长曲线，曲线呈S型，悬浮培养细胞从第4天开始进入快速生长期，到第10天左右生长逐渐减慢，进入停滞期。由此可以选择细胞生长最佳时期进行遗传转化，这将有助于转化率的提高。 4．确立了适合于葡萄转化体筛选的抗生素的种类及浓度：在卡那霉素、G418、新霉素三种氨基葡糖苷类抗生素中，新霉素筛选效果最佳。培养5周后的细胞团在80mg/L的新霉素的选择压力下增殖为0，在此基础上进一步确立最佳筛选方式：在转化后用含 盂岩 摘 要．221年11月 80mg／L新霉素的固体培养基筛选或在将新霉素浓度由 30mg／L－50mg／L—S0mg／L逐步 提高的固体或液体培养基均可得到较好的筛选效栗。 5．探讨了影响遗传转化效率主要因素。 a．研究了不同菌株对转化的影响，通过调查抗性芽产生效率确立对葡萄材料侵染能 力强的菌株类型和对之敏感的受体材料类型。结果是 EHA 05的侵染能力显著高于 LBA4404。胚性愈伤较胚性培养细胞更为敏感。 b．通过对影晌转化的几个主要因子的正交试验，并对正交试验结果进行分析，确定 当试验组合为试验材料为大细胞团、菌液OD。＝0．6、共培养4天、共培养培养基pHS．2 时为最优试验组合。这正好和本试验中试验5的结果相吻合。通过极差分析，确立各因 素的主次颇序为：共培养培养基叫值＞植物材料＞菌液浓度＞共培养时间。本试验中最主 要的影响因素是共培养培养基pH值。 C研究酚类化合物对转化的影响，共采用了 5种酚类化合物，三种浓度（stheg／l。 100mg／l、150mg／l）处理葡萄胚性愈伤组织，以每 50mg愈伤组织经 GUS色后所产生的 蓝点数作为遗传转化效宰的指标，试验结果表明，乙酝丁香酮的效果远远好于其他处理， 差异显著性达极显著水平。 d．研究负压处理对转化的影响，研究发现，对于某一特定植物材料来讲，农杆菌侵 染时采用不同的真空强度处理不同时间，对GUS瞬间表达率会产生不同的影响。其中， 对于胚性愈伤来讲，采用0刀6M邯处理15分钟，＊＊s瞬间表达率显著高于对照：对于 悬浮培养细胞而言，采用0．06／Mpe处理5分钟，GUS瞬间表达率显著高于对照。除此 之外，其它处理下的GUS瞬间表达率均显著低于对照。 6．对防止共培养及共培养后愈伤组织褐化问题进行研究，发现不同转化过程对愈伤 褐化的影响极大，在转化时将二次活化菌液离心后去上清，侵染时用YEB培养基重悬并 稀释一定倍数，侵染后转人共培养培养基中共培养。愈伤共培养后在除菌用液体培养基 中先振荡培养30分钟，静置后用移液器吸去上清，再用液体除菌培养基洗涤，用无菌滤 纸吸于后在固体除菌培养基中继续培养，可以使愈伤褐化率降至0。另外，采用聚乙烯 毗咯烷酮（PVP）等5种抗氧化剂，考查不同抗氧化剂对减轻愈伤侵染后褐化的作用。 发现除PVP对减轻褐化效果不显著外，其它抗氧化剂均对褐化