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猪细小病毒NS1基因与VP2基因的克隆、表达及VP2基因免疫的研究

吴丹  
【摘要】: 猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)感染是一种严重危害养猪业的病毒性疾病,广泛分布于世界各地,至今尚未得到有效的控制。因此研制有效疫苗来防制本病依然是一项十分紧迫的任务。 NS1蛋白是PPV的非结构蛋白之一,由NS1基因编码。NS1蛋白对PPV早期和晚期的基因转录都发挥着重要的调节作用。由于病毒灭活后不表达NS1蛋白,利用该蛋白作为诊断抗原可以区分灭活疫苗免疫猪和野毒感染猪。本实验室在1999年从污染了猪细小病毒的PK15细胞系中分离得到了一株PPV,定名为SY-99株。以SY-99株的基因组DNA为模板,利用PCR扩增出了NS1基因,将其克隆到原核表达载体pET28a中,获得重组质粒pET28a/SYNS1。序列测定结果显示,NS1基因全长1989核苷酸,编码662个氨基酸。在推导的氨基酸序列中含有在PPV复制过程中发挥重要作用的保守基序GKRN,并有三个潜在的糖基化位点,分别位于356-359、446-449和513-516位氨基酸。序列比较表明,SY-99株与NADL2-1株、NADL2-2株和Kresse株NS1基因的核苷酸同源性分别为98%、99%和99%,氨基酸同源性分别为97%、99%和99%。将重组质粒pET28a/SYNS1转化到大肠杆菌BL21(DE3)株中,所得的重组菌株经IPTG诱导后,表达出高水平的NS1蛋白,表达率可达17.8%。经ELISA和Western Blotting检测,表达的重组蛋白具有免疫学活性。经过优化选择确定了NS1蛋白高效表达的最适参数。表达产物带有组氨酸标签,适于用His·Bind柱亲和纯化。重组NS1蛋白为制备PPV诊断抗原用于本病的流行病学调查提供了一种检测工具。 当前用于PPV免疫防制的疫苗主要是油乳剂灭活苗和冻干弱毒苗,这两种常规疫苗都存在一定的缺陷,如生产疫苗所用的猪源传代细胞系或原代细胞很容易污染其它病原,PPV的体外培养滴度低,难于生产出高效价的疫苗,而且弱毒疫苗还存在毒力返强的可能,所以研制新型疫苗十分有必要。PPV VP2蛋白可以形成病毒样粒子(vires-like particles,VLPs),其免疫原性与PPV病毒粒子近似,可以使接种动物获得保护性免疫。因此本研究拟用体外表达的重组VP2蛋白作为预防PPV的候选亚单位疫苗。以SY-99株基因组DNA为模板,用PCR扩增得到了VP2基因,将其克隆到酵母表达载体pPICZαB中,经测序后与PPV参考毒株NADL-2株进行序列比较,结果表明二者同源性达99.2%。经定点突变后,VP2基因中的SacI位点被缺失,构建了重组酵母转移载体pPICZαB/mVP2,经SacI线性化后,导入酵母受体菌GS115中,经甲醇诱导培养后,用SDS-PAGE检测重组菌株裂解产物,结果未检出目的蛋白条带。然后将VP2基因克隆到了另一酵母表达载体pPIC9K中,构建了酵母转移载体pPIC9K/mVP2,经转化和诱导培养后,也未检测目的条带。我们又将VP2基因靠近5,端部分进行了序列改造,构建了酵母转移载体pPICZαA/MVP2,转化酵母受体菌后诱导培养,检测结果显示,VP2仍然没 博土学位论文 摘 要 东北农业大学 有得到成功表达。在利用酵母表达 PPV VPZ的试验研究中,我们均得到了含有重组子的 阳性酵母菌株,我们对酵母生长条件进行了变化摸索,但在SDS-PAGE胶上始终没有肉 眼可见的目的条带。所以我们初步推测SY-99株WZ基因中存在不适于在酵母体系表达 的某种元件,抑或表达量过低而难于检测。 作为一种新型疫苗,基因疫苗具有安全可靠、生产简单、储运方便等优点,可望克 服常规疫苗的某些不足。我们将猪细小病毒VPZ基因及猪Y-干扰素(IFN-Y)基因同时 克隆到真核表达载体pIRESlneo中,构建了共表达VPZ和IFN-Y的基因免疫质粒 pIRESI/VPZ/Y,用此表达质粒单独或加入脂质体肌注接种 BABUC小鼠,三次兔疫后, 采取接种鼠血清,用ELISA检测特异性抗体,结果表明,脂质体可以加强表达质粒接种 小鼠的兔疫应答水平,为今后研制猪细小病毒基因疫苗提供了依据。


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