大豆组织培养体系优化与双价抗虫基因遗传转化的研究

【摘要】： 以55个东北地区主栽和国外引入大豆基因型的未成熟子叶、真叶、子叶节和下胚轴为外植体，用高浓度的生长素诱导大豆体细胞胚胎发生与植株再生，对影响大豆体细胞胚胎发生的因子大豆基因型、外植体种类、生长素种类与浓度、低温预处理时间，以及与大豆体细胞胚胎发生率有关的性状的相关性进行了研究；诱导大豆次生胚产生，探讨了与胚性组织增殖、萌发和再生植株有关的因子，优化了大豆组织培养再生体系。 以大豆未成熟子叶和胚性组织为受体，用农杆菌和基因枪两种方法对大豆进行Bt基因和CpTI基因双价抗虫基因的遗传转化，经PCR和PCR—Southern分析证明双价抗虫基因被转入到大豆中，并对影响遗传转化的因子进行了研究，主要研究结果如下： 1．以未成熟子叶为外植体成功地诱导了54个大豆基因型体细胞胚胎发生，占被诱导基因型的98.18％。在黑龙江、吉林和辽宁三省主栽的大豆基因型中筛选出体细胞胚胎发生率在50％以上的基因型8个。大豆未成熟子叶是诱导体细胞胚胎发生最好的外植体，以高浓度的2，4-D诱导体细胞胚胎发生效果更好。在诱导大豆体细胞胚胎发生时基因型间存在较大的差异，体细胞胚胎发生率在0～85.83％之间。 2．建立了适合于东北地区大豆品种未成熟子叶体细胞胚胎发生与植株再生的组织培养体系，培养基成份、生长素的种类和浓度、低温预处理时间等因子对大豆不同品种的体细胞胚胎发生率均有影响。MS培养基附加高浓度的2，4-D，加或不加有机物(脯氨酸和腺嘌吟)，在接种前将大豆幼荚在4℃低温预处理3～4d，可提高大豆未成熟子叶体细胞胚胎发生率。接种时大豆未成熟子叶以3～5mm为宜，并与大豆品种的生育期有关，早、中熟品种在大豆开花16～20 d取荚，晚熟品种在大豆开花20～24 d取荚可获得较高的体细胞胚胎发生率。 3．构建了以大豆未成熟子叶为外植体诱导生产上大面积栽培的大豆品种产生次生胚，在固体培养基上增殖胚性组织，并再生结实植株的组织培养新体系，研究中发现胚性组织的增殖与2，4-D浓度和光照条件有关。 4．深入、系统地研究了抗生素对大豆品种生长发育的抑制作用。卡那霉素作为抗性选择标记所需浓度因不同大豆品种、不同外植体(真叶、子叶节、下胚轴、未成熟子叶和胚性组织)、外植体不同发育阶段(体细胞胚胎发生、胚萌发和再生植株)而各异，变化范围为25～100mg／L。不同根癌农杆菌菌株在侵染大豆不同外植体后所需脱菌剂的种类和浓度亦不同，LBA4404的最佳脱菌剂为头孢霉素，浓度依外植体的不同为200～500mg／L。 5．用农杆菌介导法对生产主栽大豆品种吉林35、吉林43和合丰35未成熟子叶进行了遗传转化，诱导体细胞胚胎发生和植株再生，移栽成活15株，12株PCR检测呈阳性反应，用地高辛标记Bt基因探针进行PCR-Southern分析，12株均呈阳性，证明Bt基因已整合到大豆基因组中，转化率依大豆品种、农杆菌菌液浓度、侵染时间和共培养时间不同变化在0～2.00％之间，平均转化率为0.56％。农杆菌介导的大豆遗传转化率主要 博士学位论文 大豆组织培养体系优化与双价抗虫基因遗传转化的研究 东北农业大学 受大豆基因型、共培养时间的影响，吉林43易于农杆菌介导的遗传转化，共培养时间以 1～2 d为宜。胚性组织农杆菌介导的遗传转化得到了 GUS基因的稳定表达，经PCR检测 证明，首次将BZ和巾TI双价抗虫基因转入大豆细胞中。 6．基回枪轰击大豆未成熟子叶和胚性组织得到了GUS基因的表达，发现轰击后适当 地延长大豆未成熟子叶在后高渗培养基中停留时间可提高基因枪转化效率。