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乳酸菌优良菌株的选育及直投式酸奶发酵剂的研制

张兰威  
【摘要】: 为了提高我国酸奶的品质和生产水平,缩小与发达国家在直投式酸奶发酵剂的差距,本课题对酸奶菌种(嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌)的大量菌珠进行选育,并从工业化生产的角度考虑系统研究了高活力乳酸菌发酵剂增菌、冷冻干燥,多菌种组合的机理和工艺条件。结果如下: 1.乳酸菌菌株的分纯及选育 由不同来源商业发酵剂BS和直投式发酵剂DVI在特定培养基上划线分纯,得到20珠球菌、12珠杆菌。菌株经活化后连续五代发酵脱脂乳,综合考虑酸度、pH值、感官、粘度和和凝固时间各项指标,选出六株杆菌分别为:350L、380L、TM-111L、V1L、95L及前期优选B3L,球菌五株分别为:TM-111S、900S、96S、YC380、SH9。经形态学和生理生化初步鉴定,可以初步判定所选择的球菌为嗜热链球菌,杆菌为保加利亚杆菌。 将优选出的球菌和杆菌以1:1混合发酵脱脂乳,根据滴定酸度、pH值和粘度选出发酵性能最好的球菌和杆菌组合为:TM-111S与TM-111L、900S与95L、900S与TM-111L、900S与V1L、TM-111S与B3。 2.优选的保加利亚杆菌菌株紫外诱变及驯化 对保加利亚杆菌B3、TM-111L进行紫外菌种诱变选育,选取致死率为80~90%的紫外照射条件为:选择在20w紫外灯,菌悬液距紫外光源30cm,照射2min。经过复筛选出4株对低酸敏感的保加利亚乳杆菌,但经过第一次传代,只有一株显示了对酸度敏感,而经过第二次传代,所有诱变的保加利亚乳杆菌菌珠对酸度敏感的特性都全部丧失。 3.高活力乳酸菌的增殖培养 根据优选L.b和S.t在经典培养基中生长,选定S.t和L.b增菌培养基的基质为:4%脱脂乳和5%的酶解乳清(水解时间60min,1:1配合)。通过增殖因子的单因素试验效果和正交试验确定增菌培养基(1)S.t最佳配方为:5%蕃茄汁、0.7%酵母粉、5%麦芽汁;2%乳糖、0.5%缬氨酸、1%碳酸钙。(2)L.b最佳配方为:5%番茄汁、5%麦芽汁、0.7%酵母粉;2%乳糖、70mg/kg甲酸。 另外,补加10%Gq可以提高球菌的活力。 控制发酵过程温度、pH值,对乳酸菌的产酸活性影响很大,其中球菌更适合在PH值较高(6.1)、温度为41℃条件下生长;杆菌更适合在pH值较低(5.7)、温度为41℃条件下生长。采用磷酸盐缓冲液在菌生长高峰期缓冲能力不能满足需要,不适合产酸量大的乳酸菌增殖。增菌过程充气体N_2、CO_2,对菌体并无提高。 运用三因素二次饱和D-最优化设计(311A),得到球菌S.t培养条件的回归方程为:y=-83.07+2.40x_1+10.15x_2+0.99x_3+0.03x_1x_2-0.02x_1x_3+0.02x_2x_3-0.03x_1~2+0.03x_2~2-0.04x_3~2在培养温度41.8℃,pH值6.1、培养时间4.6h可获得最大产乳酸活力0.59%。运用三因素二次饱和D-最优化设计(311A),得到杆菌L.b培养条件回归方程为:y=-67.58-1.79x_1+9.57x_2+0.82x_3+0.02x_1x_2-0.01x_1x_3-0.02x_2x_3-0.02x_1~2-0.88x_2~2-0.04x_3~2在培养温度42.5℃、pH值5.9、培养时间4.7h,可获得最大产酸活力0.50%。 按照优选增菌培养基和条件在全自动发酵罐中增菌,结果*上菌产酸活力在4h后下 降;而SJ菌在增殖3.5~4h后,球菌的产酸活力下降。对增菌过程中菌体特征观察可以发 现,在产酸活力达到最高之前(4h)L上为短而直的杆状,达到最高产酸活力后菌体为长 而弯曲的杆状,并且在菌体内有着色不均匀的颗粒。 将球、杆菌混合组成酸奶发酵剂,以球菌增菌4.sh、杆菌增菌3.sh发酵脱脂乳的产酸 活力最高;另外,从各增菌阶段的杆菌与增菌4刀~4.sh的球菌混合其发酵活力无明显差 别可以看出,杆菌的最初活力在实验范围内对酸奶发酵剂的活力影响不大。增菌培养基中 增殖的发酵剂其产酸活力明显高于传统发酵剂的巾<0刀5),这证实实验所选的增菌培养 基是有效的。 将球菌和杆菌以初菌数1*比例混合在增菌培养基中,无论温度如何都遵循球菌先迅 速生长,而在温度38C~44oC培养球菌数量始终占优势;Zh后杆菌比例增加趋于平衡, 这一变化规律受培养温度影响,较高温度培养有利杆菌生长,而使球杆菌比例达到平衡的 时间较短。较高pH值6刀有利于混合培养的总菌数增加,但是球菌杆菌比例不平衡,即 球菌的数量远远高于杆菌;较低pH值培养总菌数低,但球杆菌比例随培养时间延长而趋 向于平衡。 4.营养物质及代谢产物对曹体生长的影响 在发酵过程中乳糖消耗量约为中和用氢氧化钠的4倍,因此在乳酸菌增菌过程中根据 NaOH的消耗量补加乳糖是必要的。补加乳糖量为:保加利亚乳杆菌(Lb)为碱量的4倍 (按重量比)即可满足需要;而嗜热链球菌(S【)则在优选培养基之中再加 1%的乳糖, 并在增菌过程中以4倍碱的量补加乳糖可获得更高的菌活力. 将增菌发酵液分做抑菌试验,通过测定抑菌圈证实增菌过程中发酵液对菌体本身有抑 制作用,这种抑制作用随着发酵时间的延长而增强:球菌在增菌培养基中发酵3刀h,杆菌 在增菌培养基中发酵4h后其发酵液对自身菌的抑菌能力明显增强。通过添加 Ca(LC)。 和 Na(LC)可知,中和剂对微生物菌体有抑制作用。同时 SDS-聚丙烯酚胺凝胶电泳分析 发现在发酵液中有nisin成分的低分子蛋


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