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长期液态保存的公猪精液中精子的活率、线粒体活性、获能和顶体完整性检测

霍立军  
【摘要】: 由于精子解冻后的低成活率和人工授精后的低繁殖率,使得猪精液冷冻技术难以得到推广。猪精液的液态保存避免了冷冻及解冻过程,而且用低密度的精液进行人工授精时也能获得较高的受精率。但随着精液在体外保存时间的延长,精子的受精能力会逐渐降低。所以,猪精液在液态长期保存过程中的精子质量评定就显得特别重要。 本研究对用Androhep、Zorlesco、BTS及KIEV四种稀释剂稀释保存的公猪精液,在17℃保存1~15天过程中的精子质量从质膜完整性、线粒体活性、顶体完整性和获能状态进行了检测。利用Hoechst 33258和SYBR-14/碘化丙锭(PI)分别检测精子死活;利用JC-1检测精子线粒体活性;利用考马斯亮蓝染色检测精子顶体状态;利用金霉素(CTC)检测精子是否活获能。结果发现,SYBR-14/PI和Hoechst33258两种染色方法检测精子死活都很灵敏,前者检测的活精子比例较后者稍低,但都低于JC-1检测的线粒体有活性的精子比例。精子活率和有活性线粒体的精子在保存的前8天都是缓慢减少。第13天时有活性线粒体的精子比例分别为53.8±2.10%(Zorlesco)和57.7±1.60%(Androhep)。Hoechst33258、SYBR-14、JC-1和考马斯亮蓝检测结果高度相关(r≥0.9461),考马斯亮蓝检测的精子顶体完整率比SYBR-14/PI、Hoechst 33258和JC-1检测的精子活率高。BTS、Androhep和Zorlesco保存前9天的精子获能比例都低于15%,但从第13天以后,大部分活精子都已获能。获能比例和顶体状态分别在第9~14天和第11天变化较大。这四种稀释剂保存15天后的精子获能率接近70%。利用Androhep和Zorlesco保存13天、BTS保存10天及KIEV保存9天的精液中精子活率、顶体完整率及有活性线粒体的精子比例仍高于50%。四种稀释剂的低温保存效果依次为:Androhep>Zorlesco>BTS>KIEV。 此外,本实验中还检测了公猪精液在4℃、15℃、20℃和39℃体外保存48小时过程中的精子质膜完整性、线粒体活性、顶体完整性和获能状态。SYBR-14/PI、Hoechst 33258和JC-1检测结果也高度相关(r>0.98)。新鲜射出的公猪精液中精子活率大于94.7±1.8%,有活性线粒体的精子比率为95.7±1.6%。4℃保存后,精子活率显著下降。39℃保存前4小时精子活率下降比较缓慢。15℃和20℃保存中精子活率显著高于4℃和39℃保存的精子活率。JC-1检测的有活性线粒体的精子比例和考马斯亮蓝检测的顶体完整率与SYBR-14/PI和Hoechst 33258检测的精子活率结果类似。15℃和20℃保存超过24小时后大量精子获能,在48小时获能比率分别达到62.2±2.0%和88.9±2.2%,大部分获能的精子都是顶体完整的。这些结果提示,SYBR-14/PI、Hoechst 33258和JC-1染色方法都能够有效地评估公猪精液体外保存过程中的精子质量,在20℃保存48小时的公猪精液仍有可能用于体外受精或人工输精。


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