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马流感病毒青海株相关特性研究及其基因组分析

杨建德  
【摘要】: 马流行性感冒(Equine influenza,EI),是危害养马业和赛马业的一种十分重要的接触性呼吸道传染病,主要表现咳嗽、喷嚏、发热、食欲减退,怀孕母马可发生流产症状。EI的病原为正粘病毒科A型流感病毒属的马流感病毒(Equine Influenza Virus,EIV),EIV与同属的禽流感、人流感和猪流感病毒关系较为密切。EIV基因纽全长约为13.6kb,包括有8个基因片段,分别为聚合酶(PB2、PB1、PA)基因、血凝素(HA)基因、神经氨酸酶(NA)基因、核蛋白(NP)基因、基质蛋白(M)基因和非结构蛋白(NS)基因,编码10种蛋白。过去,在我国曾发生过三次规模较大的马流感流行。1994年,从青海省暴发马流感的病马中分离出一株EIV,命名为A/Equine/Oinghai/1/94。为了弄清流行于我国马群中EIV的来源及遗传学背景,并为进一步研制有效疫苗提供科学依据,本研究着重进行了EIV青海株(A/Equine/Qinghai/1/94)相关特性研究及其基因组分析。 将EIV青海株在SPF鸡胚中连续传7~8代后,病毒的血凝滴度趋于稳定,可达到1:512以上,电镜下观察具有典型的正粘病毒粒子形态,病毒粒子大多是球形,有囊膜,个别为丝状,平均直径100nm。血凝活性的温度敏感性试验结果表明,73℃以上作用10分钟和71℃以上作用30分钟,血凝活性丧失。对EIV青海株进行的实验动物感染试验证实,经滴鼻和肺脏接种双重途径可在小鼠、大鼠、豚鼠和兔体内产生EIV HI抗体,仅在小鼠产生可见的精神萎靡、发抖、呼吸困难等症状,没有观察到有死亡现象。剖检可见发病小鼠肺脏充血、淤血、肿大,从其肺脏分离出有血凝活性的病毒,电镜观察为典型的正粘病毒形态;在大鼠、豚鼠和兔未观察到明显的临床症状及病理学变化,也未分离出病毒;抗体水平监测结果显示,在兔体内产生的EIV HI抗体水平明显要高于小鼠、大鼠和豚鼠的抗体水平。 HA是EIV最重要的结构蛋白和免疫保护性抗原,其基因在基因组中变异频率也最高。为了明确我国EIV之间的亲缘关系、EIV与禽流感病毒的关系及我国EIV在世界EIV中的地位,本研究克隆了国内3株EIV HA基因,测序后,构建了我国EIV与一些禽源和马源流感病毒HA基因进化树。通过HA基因序列比较分析发现,我国A/Equine/Qinghai/1/94株和1992年香港分离出的2株EIV关系密切,核苷酸同源率可达95%,这3株病毒均属于国际上典型的H3N8亚型EIV;而我国A/Equine/Jilin/1/89及A/Equine/Heilong jiang/1/89株与A/Equine/Qinghai/1/94株的同源率均为82.6%,通过进化树分析发现,这2株病毒均来源于禽。 用10日龄SPF鸡胚繁殖青海株EIV,从接种该毒株的鸡胚尿囊液中提取病毒基因组RNA,根据genebank中已发表的相应核苷酸序列设计并合成针对各基因的特异性引物,通过反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增8个基因片段的cDNA,扩增的PCR产物经胶回收纯化后,克隆到pGEM-T-easy载体上,重组质粒经酶切鉴定后进行序列测定。序列测定正确后,通过计算机软件对其进行分析,并与国内外参考毒株进行比较,结果发现,克隆的A/Equine/Qinghai/1/94 HA基因1738bp,编码575个氨基酸(AA);NA基因1450bp,编码484个AA;NP基因1554bp,编码515个AA;M基因978bp,编码326个AA;NS基因813bp,编码226个AA;PB2、PB1和PA基因分别为2331bp、2332bp、2224bp,编码774、775、740个AA。通过构建各基因进化树及序列比较分析发现,EIV青海株的各基因在核苷酸和氨基酸水平上与欧洲的EIV参考毒株关系最为密切,因此推断,我国A/Equine/Qinghai/1/94毒株可能来源于欧洲。 根据HA基因阅读框架和pcDNA5.0的酶切序列设计一对引物,上游引物含有HindⅢ 东北农业大学农学博士学位论文 一 酶切位点和KOZ8k翻译起始序列,下游引物含有Bedl$切位点。通过PCR反应,从pGCh-HA 扩增出带有Kozak翻译起始序列和酶切位点的HA基因,并将该基因与pcDNAS.0经 Hindlll、BalllHI酶切,股回收纯化后连接。经过酶切鉴定和核昔酸序列测定分析,本试 验成功地构建了真核表达质粒P。DNA-HA。 综上所述,本研究解析了A/Equine/Qinghai/l/94毒株基因组全序列,从HA角度明 确了我国EIV间的遗传演化关系,成功地构建了真核表达质粒P。DNA-HA,并对该毒株相关 的特性进行了研究,建立并完善了马流感诊断的HI试验方法,为揭示EIV遗传演化关系 及研制EIV有效疫苗和诊断试剂奠定了基础。


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