蓝藻Na～+/H～+antiporter基因在烟草中的表达

【摘要】： 盐害一直是困扰农业生产的一个重要问题，也是造成土地荒芜的主要原因之一。仅在我国就有3亿多亩盐荒地和1亿多亩盐渍化土壤。因此，如何有效地提高作物的耐盐性，是农业生产中急待解决的问题之一，同时也是缓解我国耕地紧缺的办法之一。 Na~+／H~+运输蛋白是位于质膜和液泡上的一类运输蛋白，它可以逆电化学梯度将Na~+排出细胞外或区隔化于液泡中，普遍存在于藻类与盐生植物中。本研究所使用的SynNhap基因，是蓝藻(Synechocystis pcc6803)质膜Na~+／H~+运输蛋白基因，全长1581bp(不包括终止密码子)，编码527个氨基酸。将它转入到大肠杆菌To114(盐敏感型)中，可以恢复其在含NaCl培养基中的生长能力。 根据SynNhap基因序列设计全长基因扩增引物，在引物两端分别加上Xba Ⅰ和Sma Ⅰ的酶切位点识别序列，通过PCR法将SynNhap基因从最初的克隆载体pTrchis2c中扩增出来，连接到pGEM-T Easy上，构建中间载体pGEM-T Easy-Nhap，经测序确认后，保留未发生碱基突变的克隆体，用于以后的农杆菌转化载体pBI121-Nhap与花粉管导入法载体pEmu-mcs-N-Nhap、pWubi.tml-Nhap的亚克隆。 采用叶盘法法转化烟草。经组织培养后，以PCR和RT-PCR法检测再生烟草，共得到转SynNhap基因烟草4株，pBI121空载体浸染的对照烟草再生苗5株。通过比较转SynNhap基因烟草与对照烟草的耐盐性，发现4株转SynNhap基因的烟草再生苗在含150mM NaCl的培养液中处理两周后，植株外观无明显变化，叶片生长情况正常，而对照植株的生长则受到抑制，叶片明显萎蔫、失绿并最终脱落。分别取盐胁迫下转SynNhap基因烟草与对照烟草的叶片，以火焰光度计法检测Na~+含量，发现转SynNhap基因烟草叶片中Na~+的干重含量明显低于对照。由此判断，在转SynNhap基因的烟草再生苗中，SynNhap基因已经表达，生成了Na~+／H~+离子运输蛋白，加强了细胞对Na~+的外排功能，从而提高了转基因烟草的耐盐性。 用载体pEmu-mcs-N-Nhap进行小麦花粉管导入法的转化。共得到转化后的小麦种子347粒，但未能在其中检测到阳性结果。