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黑龙江省部分地区PED流行特征及病毒生物学特性研究

郎景华  
【摘要】: 猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的以腹泻、呕吐和脱水为主要临床特征的猪消化道传染病。该病在我国及世界各养猪国家广泛分布,其对仔猪的危害严重,致死率高。 本实验对黑龙江省不同地区的5个腹泻病发生的猪场经临床初步诊断、实验室PCR技术和病原分离,确诊其中的两个猪场为猪流行性腹泻。证明了黑龙江地区存在有猪流行性腹泻。这两个养猪场哺乳仔猪发病率为72.69%和89.95‰其他年龄猪为68.07%和75%;哺乳仔猪死亡率为62.88%和81.31%,其他年龄猪为8.31%和10.37%;从发病年龄看,虽然各种年龄的猪均有发生,但死亡多在4周龄以下哺乳仔猪;发病季节均为冬春寒冷季节,临床表现以水样或稀薄黄白色腹泻为主要特征。 本实验对PCR阳性的腹泻粪便样品进行了病毒分离。粪便毒在Vero细胞上进行连续盲传,现已传20代次。在17代之前,感染细胞无明显变化,在传至18代时,表现为细胞轮廓不清,细胞颗粒增多,培养液中死亡细胞增多。并以每隔5个代次采用RT-nested PCR技术检测PEDV M基因,结果表明,在第5、10、15和20等不同代次的细胞培养物进行的Nested-PCR均为阳性结果,说明分离毒确已在细胞中得到了稳定生长。该细胞适应病毒的获得为我国PEDV地方分离株血清学、免疫学、病原生物学以及疫苗研制等提供了重要的物质基础。 本研究根据Genebank中PEDV CV777和Br1/87 M基因的保守序列设计引物,通过RT-PCR和Nested-PCR方法在我国首次从患病猪的粪便中扩增获得了我国地方株LJB/03 M全基因序列。将其插入克隆载体质粒pMD18-T,并进行测序。测序结果显示LJB/03株M基因核苷酸序列全长681bp,含有完整的开放阅读框架,编码226个氨基酸,将其核苷酸序列及推导的氨基酸序列与已发表Br1/87和CV777两个国外同源标准毒株M基因进行比较,核苷酸序列与Br1/87比较分别在37、47、138、179、192、213、269、285、348、448、579、597、618、629等14个核苷酸存在差异,同源性为97.94%;与CV777比较分别在37、47、138、179、192、213、269、285、348、579、597、618、629等13个核苷酸存在差异,同源性为98.09%;推导的氨基酸序列与Br1/87株和CV777株M基因相比,分别有5个和4个氨基酸差异,同源性分别为97.79%和98.23%,而CV777和Br1/87M基因之间核苷酸序列仅有1个核苷酸不同,同源性99.85%,推导的氨基酸序列同源性99.56%。因此LJB/03株与CV777和Br1/87M基因存在一定变异。


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