兔产气荚膜梭菌（A型）α毒素原核表达产物免疫原性分析

【摘要】：兔产气荚膜梭菌病(Clostridium perfringens disease)是由A型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)引起的兔的一种消化道传染病，各年龄、各品种兔均可发病，以幼兔和青年兔发病率最高，死亡率可达100％，严重危害养兔业的发展。对于该病主要致病因子α毒素的研究具有重要意义。 本实验从A型产气荚膜梭菌(NJ株)的总DNA中，通过PCR扩增出α毒素全基因，构建克隆载体pMD18TCα。测序结果显示A型产气荚膜梭菌(NJ株)的α毒素基因全长1194bp，含有完整的开放阅读框，编码398个氨基酸，其中前28aa为信号肽，后370aa构成成熟的α毒素。将核苷酸序列与GeneBank中已发表的菌株NCIB19681(typeB)、NCIB10662(typeC)和L9(typeD)的α毒素基因序列进行比对，同源性达到99.27％。将α毒素全基因从克隆载体pMD18TCα亚克隆到表达载体pPRO-EX HTb中，构建表达载体pPROHTbCα，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了诱导表达研究。 将α毒素基因部分序列从克隆载体pMD18TCα分别亚克隆到表达载体pPRO-EX HTa和pET-30b中，获得重组表达载体pPROHTaPα和pET30bPα，并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达出特异的大小分别为36KD和38KD的融合蛋白。光密度扫描分析重组菌BL21(DE3)pET30bPα表达的蛋白含量达到30％，经金属亲和层析获得高纯度的His-tagged融合蛋白。采用Western-blot分析表明，重组菌BL21(DE3)pPROHTaPα和BL21(DE3)pET30bPα表达出的特异性产物和纯化产物均具有和α毒素抗血清反应的抗原特异性。 把以包涵体形式存在的表达的重组蛋白α toxinA和α toxinB，以尿素变性，经复性、浓缩后获得了可溶性的蛋白质，并对可溶性蛋白α toxinB凝胶过滤层析的纯化方法进行了摸索。 免疫琼脂扩散实验的结果表明表达的重组蛋白α toxinA和α toxinB可以和α毒素抗血清发生免疫沉淀反应；免疫家兔获得抗α toxinB的抗血清和抗α toxinA的抗血清都可以和A型产气荚膜梭菌强毒株产生的α毒素发生免疫沉淀反应。 本研究为兔产气荚膜梭菌病的流行病学调查、诊断试剂的开发以及基因工程疫苗的研制提供了理论依据和物质基础。