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小麦T型细胞质雄性不育相关蛋白的表达及育性恢复基因Rf3的分子标记的研究

王继华  
【摘要】:本研究以近等基因系创建的四个实验品系S-165[(B)rf3/rf3]、1031-1(1032-1)[(T)Rf3/Rf3]、反交品系[(B)Rf3/rf3]、不育品系[(T)rf3/rf3]为材料(其中S-165与不育品系为同核异质,1031-1与不与育品系之间为同质异核),结合发育遗传学理论和聚丙烯酰胺凝胶双向电泳技术来检测小麦不同发育时期幼穗中的蛋白质差异,在完成花粉单核期、花粉母细胞减数分裂时期比较分析之后,本研究集中对孢原细胞时期和孢母细胞时期的小麦幼穗可溶性蛋白差异进行分析。同时采用AFLP分子标记技术,对小麦雄性不育育性恢复基因Rf3的近等基因系进行了比较,力求揭示T型小麦胞质雄性不育和育性恢复的分子机理。 1.IEF(等电聚焦电泳)双向凝胶电泳结果表明:不育品系缺失一个20.8KD的多肽,不育品系孢原细胞时期缺失21.3KD、22.3KD和22.4KD 3个多肽,推测它们与育性形成有关;孢母细胞时期特异表达21.7KD、23.0KD和48.4KD、49.0KD 4个多肽,推测与不育性状的出现有关;51.6KD的多肽只在1031孢母细胞时期特异表达,推测与育性的恢复有关系;53.0KD的多肽为1031特有,可能是育性恢复相关蛋白,可以肯定它一定受Rf3基因的调控。 2.SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析表明:57.0KD、53.0KD、49.0KD、34.0KD、24.4KD和11.8KD 6个多肽是不育品系两个时期都不表达的蛋白,推测它们是与育性相关的多肽,这些多肽的不表达可能导致了育性形成过程中的关键蛋白;40.6KD的多肽为B型细胞质特有。 3.NEPHGE(非平衡PH梯度电泳)结果表明:29.5KD多肽在1031孢原细胞时期表达,在孢母细胞中不表达,推测这个多肽的编码基因是时序表达的基因或是1031品系中特异表达的基因。 4.根据实验结果,对发育过程中的雄性不育和育性恢复机制提出新的观点,认为导致不育的基因产物和育性恢复基因产物各自独立表达;调控基因表达的时空性明显:时间上讲,同一品系在孢原细胞时期和孢母细胞时期的表达差异不大,而不同品系同一发育时期差异较大;空间上,总结各阶段实验结果,营养器官(叶片)在不同发育时期的蛋白表达差异不大,生殖器官差异较大。 5.采用AFLP分子标记技术共获得差异条带32条,显示在小麦T型细胞质雄性不育育性恢复基因Rf3的近等基因系(1031-1,1032-1)及供体亲本(T.spelta var.duhamelianum)和轮回亲本(T.aestuvum cv.S165)之间,在其基因组水平上存在 WP=5 差异。 6.对其中8个条带进行回收、标记,应用Southern blot方法进行验证,其中3个条带有特异的杂交信号,证实了结论的可信性。 7.进一步测序得到了两个序列,其中一个基因序列编码的蛋白质与Hip1/Sla2具有相同的结构域。Hip1/Sla2在细胞结构、能量代谢、凋亡等方面有重要作用,因此,推测小麦雄性不育与这些过程可能相关。另一个为全新的基因序列。这一结论为进一步定位Rf3基因,及克隆控制植物雄性不育的基因,解释植物雄性不育的机理奠定了基础。 8.本文首次应用了双向电泳中的NEPHGE胶电泳并在实验操作技术上做了改进,取得了很好的实验效果。根据课题进展情况,文中提出了IPG凝胶电泳系统、三维电泳的设想。


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